1、目的:1.通過(guò)轉(zhuǎn)染SiRNA干擾人YB-1基因的質(zhì)粒(SiYB-1)和攜帶人YB-1基因的腺病毒表達(dá)載體pAdlEasy/YB-1(AdYB-1),探討YB-1與小劑量三氧化二砷(As2O3)誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞及胃癌BGC-823細(xì)胞自噬的關(guān)系。2.從自噬相關(guān)基因Beclin1和Bcl-2調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制著手在基因和蛋白水平初步探討YB-1調(diào)控自噬的機(jī)制。
　　 方法:1.Western-blot方法檢測(cè)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Si

2、RNA干擾YB-1和腺病毒轉(zhuǎn)染pAdlEasy/YB-1過(guò)表達(dá)YB-1的MCF-7細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞中YB-1蛋白表達(dá)的變化。2.4μM/LAs2O3作用于轉(zhuǎn)染SiYB-1和AdYB-1的MCF-7細(xì)胞及BGC-823細(xì)胞,運(yùn)用Western-blot的方法檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達(dá),MDC自噬特異性染料熒光染色觀察自噬泡的聚集綜合評(píng)價(jià)YB-1對(duì)As2O3誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬的影響。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3、(qRT-PCR)和Western-blot的方法檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1和Bcl-2在MCF-7細(xì)胞及BGC-823細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組中的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)情況。4.轉(zhuǎn)染AdYB-1的MCF-7細(xì)胞及BGC-823細(xì)胞,用Bcl-2的抑制劑HAl4-1預(yù)處理后再用As2O3誘導(dǎo),Western-blot方法檢測(cè)各組中蛋白LC3-Ⅱ、p62和Beclin1的表達(dá),MDC染色觀察自噬泡的聚集。
　　 結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染SiYB

4、-1和AdYB-1的MCF-7細(xì)胞及BGC-823細(xì)胞,經(jīng)Western-blot方法檢測(cè),與無(wú)意干擾組(HK)和空病毒組(AdGFP)相比,兩細(xì)胞的SiYB-1組YB-1蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.05),AdYB-1組YB-1蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05),顯示轉(zhuǎn)染有效。2.BGC-823細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組經(jīng)4μM/L的As2O3誘導(dǎo)后,Western-blot檢測(cè)示AdYB-1能夠抑制低劑量的As2O3誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞

5、內(nèi)蛋白LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化和p62蛋白的降解,MDC染色后顯微鏡觀察,與對(duì)照組相比藍(lán)色熒光的強(qiáng)度明顯減弱。相反,轉(zhuǎn)染了SiYB-1的腫瘤細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,由As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平進(jìn)一步增強(qiáng),自噬標(biāo)記蛋白檢測(cè)示SiYB-1組促進(jìn)了As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)化,p62蛋白的降解也明顯增加,MDC染色可見自噬泡熒光強(qiáng)度增強(qiáng),熒光顆粒明顯增多。3.BGC-823細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組經(jīng)4μM/L的As2O3誘導(dǎo)后,qR

6、T-PCR檢測(cè)顯示,與轉(zhuǎn)染對(duì)照(AdGFP)組相比,AdYB-1組Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)水平增高(P＜0.05);而干擾YB-1表達(dá)后,SiYB-1組Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)水平較其轉(zhuǎn)染對(duì)照(HK)組明顯降低(P＜0.05),Beclin1基因表達(dá)在各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western-blot的方法檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白和Beclin1蛋白,結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染對(duì)照組HK和AdGFP組相比,SiYB-1組Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)

7、,而Beclin1蛋白表達(dá)增高(P＜0.05);AdYB-1組Bcl-2蛋白表達(dá)增高(P＜0.05),Beclin1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。4.轉(zhuǎn)染了AdYB-1的BGC-823細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞,加入Bcl-2的抑制劑HA14-1預(yù)處理4h后再用As2O3誘導(dǎo),Western-blot檢測(cè)顯示,AdYB-1組Beclin1蛋白表達(dá)降低,P62蛋白降解減少,LC3-Ⅱ蛋白減少,在加入HA14-1組Beclin1蛋白恢復(fù)表達(dá),P6

8、2降解增加,LC3-Ⅱ升高。提示在Bcl-2的抑制劑HA14-1預(yù)處理后,As2O3誘導(dǎo)的自噬不能因轉(zhuǎn)染AdYB-1而被抑制。
　　 結(jié)論:1.在BGC-823細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染SiYB-1和AdYB-1改變YB-1的表達(dá)。2.YB-1能夠抑制As2O3誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的自噬水平。3.YB-1可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2、抑制Beclin1,實(shí)現(xiàn)對(duì)As2O3誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬的抑制作用,為YB-1參