1、目的:健康骨骼處于成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)骨形成與破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)骨吸收動態(tài)平衡的狀態(tài),這種平衡一旦被打破可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis)、骨硬化病(osteopctrosis)等多種骨代謝性疾病。力學(xué)刺激在調(diào)節(jié)骨骼重塑和維持骨量方面具有重要的作用,以往研究已證明有效力學(xué)刺激能促進(jìn)成骨。破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞,它由來源于單核/巨噬細(xì)胞譜系(monocyte/macrophage

2、lineage),通過多個單核的祖細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞。力學(xué)刺激對破骨細(xì)胞形成和活性的影響研究少見。
　　 體外沖擊波(Extracorporeal Shock Wave,ESW)是由壓力瞬間急劇變化產(chǎn)生的一種機(jī)械波,它產(chǎn)生的能量可經(jīng)相應(yīng)儀器二次聚焦形成高能量沖擊波,產(chǎn)生治療作用。體外沖擊波具有可定量作用于治療部位、無創(chuàng)、并發(fā)癥少、治療周期短、風(fēng)險低等許多優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)適宜能量的沖擊波可以增加成骨細(xì)胞的成骨活性,進(jìn)而促進(jìn)骨

3、折愈合。但沖擊波作為一種能量刺激形式,對破骨細(xì)胞的形成及骨吸收活性的影響,目前未見國內(nèi)外有相關(guān)研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過將體外沖擊波作用于成骨細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)體系,模擬破骨細(xì)胞在體內(nèi)與成骨細(xì)胞相互作用的環(huán)境,通過觀察破骨細(xì)胞形成過程中的形態(tài)變化、RT-PCR分析形成過程中調(diào)控基因的表達(dá)水平、ELISA檢測破骨細(xì)胞特異性蛋白分泌水平及電鏡下定量分析其骨吸收能力,探討沖擊波對破骨細(xì)胞形成及骨吸收作用的影響。
　　 方法

4、:
　　 1 骨髓血分離hMSCs及成骨誘導(dǎo):選擇10名志愿者(排除代謝性疾病),各抽取骨髓20ml,梯度離心法獲得hMSCs,常規(guī)培養(yǎng)1周后獲得大量hMSCs,采用經(jīng)典成骨培養(yǎng)基(10nM地塞米松、50uM抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸鈉)經(jīng)4周誘導(dǎo),獲得成骨細(xì)胞,ALP染色、茜素紅染色驗(yàn)證成骨細(xì)胞活性。
　　 2 成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立:10名志愿者再次骨髓穿刺獲得骨髓血20ml,密度梯度離心法獲得骨髓單個

5、核細(xì)胞(bone marrowmononuclear cells,BMMCs)。將BMMCs加入預(yù)先放置骨片的懸掛式培養(yǎng)皿,培養(yǎng)液中加入0.1μ M的1,25(OH)2VD3為破骨誘導(dǎo)劑。由此建立底層為成骨細(xì)胞,上層為破骨細(xì)胞,大分子能相互影響的共培養(yǎng)系統(tǒng)。
　　 3 體外沖擊波對共培養(yǎng)系中破骨細(xì)胞的作用:BMMCs貼壁后12小時,使用500頻次0.12mJ/mm2的體外沖擊波對培養(yǎng)系進(jìn)行干預(yù),在光鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化,培養(yǎng)

6、一周后ELISA法分析檢測培養(yǎng)液中組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b、白細(xì)胞介素1β,腫瘤壞死因子α的含量,RT-PCR分析破骨細(xì)胞RANK,NFATc1和c-Fos表達(dá)水平,行TRAP染色,定量分析ESW對破骨細(xì)胞形態(tài)及融合的影響,骨片電鏡掃描分析骨陷窩數(shù)量及面積。以單個核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)ESW干預(yù)組,單獨(dú)培養(yǎng)組及共培養(yǎng)非干預(yù)組組為對照。對所有數(shù)據(jù)x±s表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,方差分析比較其差異,設(shè)定P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

7、結(jié)果:
　　 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)28天后,經(jīng)ALP和茜素紅染色,可見鈣結(jié)節(jié),證明已獲得高活性成骨細(xì)胞。加入單個核細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系后,各組單個核細(xì)胞在1-3天都可見聚集趨勢,聚集密度2-10個不等,但此時仍可見細(xì)胞膜完整,未發(fā)生融合。4-6天可見細(xì)胞逐漸融合,形成2-6個核不等的多個核巨細(xì)胞。經(jīng)ESW干預(yù)組與未干預(yù)組相比,細(xì)胞融合發(fā)生較晚,融合后形成的細(xì)胞核數(shù)量較少。
　　 2 ELISA法檢測破骨細(xì)胞特異性蛋

8、白分泌水平,共培養(yǎng)干預(yù)組組織蛋白酶K2.23±0.35ng/ml,TRAP5b1.53±0.29ng/ml,IL1β53.28±7.45 ng/ml,TNFα5.87±0.80ng/ml,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)明顯低于非ESW干預(yù)組,但高于BMMC單獨(dú)培養(yǎng)ESW干預(yù)組(P＜0.05),顯示共培養(yǎng)中成骨細(xì)胞分泌的相關(guān)因子促進(jìn)了破骨細(xì)胞特異性蛋白的分泌,但ESW對這些蛋白的分泌有抑制作用。RT-PCR檢測RANK,NFATcl和c-Fos基因表達(dá)

9、水平,沖擊波干預(yù)組熒光亮度低于未干預(yù)組,證明沖擊波抑制了破骨細(xì)胞形成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。
　　 3 培養(yǎng)后的單個核細(xì)胞經(jīng)TRAP染色,各組細(xì)胞均被染為酒紅色,證明各組均表達(dá)特異性抗酒石酸酸性磷酸酶,所產(chǎn)生的細(xì)胞為破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞融合指數(shù)ESW干預(yù)共培養(yǎng)組為0.46±0.10,未干預(yù)組為0.73±0.14,兩者間有顯著性差異,證明ESW抑制了共培養(yǎng)系中BMMC的融合(P＜0.05)。掃描電鏡分析骨陷窩面積,ESW干預(yù)共培養(yǎng)組為

10、12963±952μm2,未干預(yù)組為16257±1423μm2,兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。證明ESW干預(yù)后破骨細(xì)胞骨吸收能力降低。
　　 結(jié)論:
　　 1 采用成骨細(xì)胞及BMMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)可建立人成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,可獲得足夠破骨細(xì)胞用于體外研究。
　　 2 在共培養(yǎng)系中,成骨細(xì)胞具有促進(jìn)BMMCs融合生成破骨細(xì)胞的作用。
　　 3 ESW可有效抑制共培養(yǎng)系中破骨細(xì)胞形成相關(guān)