1、目的:研究仙客來皂苷(Cyclamin)單用或聯(lián)合5-Fu體外誘導(dǎo)人肝癌細胞Bel-7402凋亡和壞死的作用及其分子機制。
　　方法:采用MTT比色法檢測Cyclamin單用及聯(lián)合5-Fu對人肝癌Bel-7402細胞的增值抑制作用;采用細胞劃痕試驗和體外侵襲小室試驗證明Cyclamin抑制腫瘤Bel-7402細胞侵襲、轉(zhuǎn)移;采用流式細胞術(shù)(FCM)分別觀察常規(guī)化療藥物單用及聯(lián)合Cyclamin處理Bel-7402細胞24小時和48

2、小時后，對其細胞周期和凋亡變化的影響;進一步用免疫印跡(Western blot)法檢測Cyclamin與5-Fu聯(lián)用，對周期調(diào)控蛋白CDK2、CyclinA、CDC25A和細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達水平的影響。
　　結(jié)果:Cyclamin抑制人肝癌Bel-7402細胞的增殖，且呈時間-劑量相關(guān)性;24h和48h時合用組（1.25μM Cyclamin+80μM 5-Fu）的抑制率分別為34.58±6.7％和54.88

3、±5.5％，與5-Fu(80uM)單用時的體外生長抑制率30.98±9.6％、40.67±10.7％(24h、48h)比較有顯著提高;聯(lián)合指數(shù)（CI值）小于1。細胞劃痕實驗結(jié)果:對照組細胞24h、48h的相對遷移距離分別為80.1±2.7％和60.2±3.4％;2.5μM的Cyclamin實驗組24h、48h的相對遷移距離分別為90.8±4.4％和82.1±5.6％，1.25μM的Cyclamin實驗組48h的相對遷移距離是79.7±2

4、.9％，與相應(yīng)時間對照組遷移距離相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。體外侵襲實驗結(jié)果:24h對照組穿膜細胞數(shù)為53.33±3.51;1.25μM和2.5μM Cyclamin實驗組的穿膜細胞數(shù)分別為35.00±1.73、11.33±1.53，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示:Cyclamin（0、1.25、2.5、5μM）處理Bel-7402細胞24h后，隨著Cyclamin濃度的

5、升高，S期細胞含量逐漸增多，在5.0μM濃度時，S期細胞含量是對照組的2.03倍，且出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰;5.0μMCyclamin的早、晚期凋亡率分別為7.4％和8.3％，隨Cyclamin劑量增加，壞死細胞率依次為1.6％、2.7％、3.5％、5.9％，呈劑量相關(guān)性;Cyclamin(1.25μM)與5-Fu(80μM)分別并聯(lián)合處理Bel-7402細胞，24h合用組S期細胞含量是52.75％，為對照組的2.22倍，且協(xié)同增加了

6、5-Fu單用時的S期細胞含量(43.66％)。48h合用組S期細胞含量39.85％，為對照組的3.28倍，雖然略低于5-Fu單藥組S期細胞數(shù)41.26％，但僅合用組出現(xiàn)明顯亞二倍體凋亡峰。24h后合用組早期凋亡率為9.9％，比對照組(0.8％)及5-Fu單藥組(6.2％)明顯提高。48h合用組壞死細胞率達15.8％，與對照組(3.9％)及5-Fu單藥組(4.4％)相比差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Western-blot蛋白免