1、支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是采用機(jī)械通氣或氧氣治療早產(chǎn)兒嚴(yán)重心肺疾病后常見的并發(fā)癥，是威脅早產(chǎn)兒健康和生命質(zhì)量的首要疾病。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，極低出生體重兒的成活率明顯提高，BPD的發(fā)病率也在不斷上升，其病理特點(diǎn)由過去顯著的肺間質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑闻莅l(fā)育阻滯為突出特征。 BPD的發(fā)病機(jī)理包括：肺臟發(fā)育極不成熟，外界損傷以及損傷后修復(fù)機(jī)制的破壞。故此，BPD的發(fā)生可簡單理解

2、為在正常肺發(fā)育過程中，外界損傷導(dǎo)致的肺發(fā)育受阻和異常修復(fù)。以往的研究多著重于對肺組織損傷機(jī)制的研究，已證實(shí)氧毒性和機(jī)械通氣介導(dǎo)的損傷、炎癥反應(yīng)在BPD的發(fā)生過程中具有重要作用，但抗炎、抗氧化的治療對BPD卻沒有取得確切的療效。隨著對BPD認(rèn)識的不斷深入，對于即參與正常肺發(fā)育又調(diào)控肺組織損傷修復(fù)機(jī)制的研究，成為研究BPD發(fā)病機(jī)制的新視野。已證實(shí)肺發(fā)育過程中，位于肺泡分隔頂端的彈性蛋白不斷向前延伸發(fā)展，是肺泡逐漸形成的物質(zhì)基礎(chǔ)；而細(xì)胞外基質(zhì)

3、的異常分布、沉積則是纖維化發(fā)生的直接原因。與兩者的發(fā)生均密切相關(guān)的肺成纖維細(xì)胞(lung fibroblast，LF)的作用日益受到人們的關(guān)注。LF的增殖活化是其執(zhí)行生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，對調(diào)節(jié)其增殖活化的信號通路的認(rèn)識將有助于我們進(jìn)一步理解LF的功能及其在BPD發(fā)生中的意義。 WNT信號通路是近年來才逐漸被人們認(rèn)識到的一類控制細(xì)胞生長、增殖、傳遞細(xì)胞間相互調(diào)控信息的信號通路。其中WNT/β—catenin信號通路作為經(jīng)典的WNT

4、信號通路，已成為發(fā)育生物學(xué)及腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量的研究證實(shí)，此信號通路活化的關(guān)鍵在于胞漿中是否存在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的β—catenin，以及其向胞核的轉(zhuǎn)位。已有研究表明，早期肺發(fā)育(即支氣管樹形成)過程中WNT/β—catenin信號通路發(fā)揮了重要作用；且在對成人肺纖維化疾病的研究中發(fā)現(xiàn)WNT/β—catenin信號通路可能起著關(guān)鍵性的作用。但在肺泡化過程中WNT/β—catenin信號通路是否存在，其作用如何，在肺泡化障礙及肺纖維化的早產(chǎn)兒

5、BPD中有何作用？到目前為止，鮮有報(bào)道。既然WNT/β—catenin信號通路參與調(diào)節(jié)肺發(fā)育及肺纖維化，且與細(xì)胞增殖分化有關(guān)，那么其在BPD中的作用是否通過促進(jìn)LF增殖活化來實(shí)現(xiàn)？ 本研究擬從組織和細(xì)胞水平，觀察WNT/β—catenin信號通路關(guān)鍵因子β—catenin及其下游基因TCF—1/LEF—1的活化情況，探討WNT/β—catenin信號通路在BPD中的作用及其機(jī)制，完善BPD的發(fā)病機(jī)制，為BPD的預(yù)防和治療提供一個(gè)

6、新思路。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、動(dòng)物模型 新生Wistar大鼠生后12h之內(nèi)隨機(jī)分為高氧組(A組)和空氣組(B組)。A組置于玻璃氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，F(xiàn)iO2=0.85±0.02(美國OM—25ME型測氧儀監(jiān)測)。用鈉石灰吸收CO2，使其濃度<0.5％(Dapex氣體分析儀)，溫度22～25℃，濕度60％～70％。每天定時(shí)開箱15min，添水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。B組置

7、于空氣中(FiO2=0.21)，余控制因素同A組。 二、標(biāo)本的采集和處理 每組分別于實(shí)驗(yàn)后3、7、14d隨機(jī)選取8只稱重，5％哥拉腹腔注射(0.6ml/100mg)麻醉后，分離氣管，打開胸腔，暴露心肺，經(jīng)氣管緩慢注入4％多聚甲醛，然后置于4％多聚甲醛中，4℃過夜，石蠟包埋，制作4μm組織切片，用于肺形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)檢測?；蛴诖蜷_胸腔后，剪開左心耳，經(jīng)右心室插入套管至肺動(dòng)脈，注入10ml生理鹽水洗凈肺內(nèi)殘血，收集肺

8、組織，置于無Rnase的Eppendorf管中，液氮速凍，—80℃冰箱保存，用于RT-PCR及Western—blot檢測。 三、細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物模型建立后，分別于實(shí)驗(yàn)第3、7、14天取每組2—3只動(dòng)物進(jìn)行肺組織LF原代培養(yǎng)，取傳2—3代細(xì)胞進(jìn)行檢測。 四、實(shí)驗(yàn)方法 1、組織水平 (1)動(dòng)態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)、監(jiān)測體重。 (2)肺形態(tài)學(xué)觀察：①H＆E染色；②彈性蛋白染色；③Masso

9、n染色。 (3)免疫組織化學(xué)技術(shù)：α—平滑肌動(dòng)蛋白(α—smooth muscle actin，α—SMA)、β—catenin蛋白檢測。 (4) Western—blot法：檢測肺組織β—catenin蛋白表達(dá)。 (5) RT-PCR法：檢測肺組織α—表達(dá)。 2、細(xì)胞水平 (1)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。 (2)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：α—平滑肌動(dòng)蛋白(α—smooth mus

10、cle actin，α—SMA)、β—catenin、波形蛋白檢測。 (3)免疫熒光：波形蛋白染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 (4) Western—blot法：檢測細(xì)胞β—catenin蛋白表達(dá)。 (5) RT-PCR法：檢測肺LF中β—catenin、TCF—1、LEF—1表達(dá)。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，單因素多水平比較采用One Wa

11、y ANOVA。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent t test。相關(guān)分析采用Spearman分析。結(jié)果以p<0.05有意義。 結(jié)論： 1、持續(xù)高濃度氧氣暴露，可導(dǎo)致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學(xué)改變，符合早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)和病理學(xué)改變。 2、肺肌成纖維細(xì)胞的異常分布(未到達(dá)肺泡分隔頂端而沉積于間質(zhì))可能是BPD肺泡發(fā)育障礙的機(jī)制之一。 3、肺肌成纖維細(xì)胞沉積于

12、間質(zhì)并過度表達(dá)，與BPD肺泡損傷后修復(fù)障礙密切相關(guān)。肺肌成纖維細(xì)胞在BPD中的異常分布、表達(dá)可能是BPD的重要發(fā)病機(jī)制之一。 4、以β—catenin為中心的WNT/β—catenin信號通路參與了BPD的發(fā)生。 5、WNT/β—catenin信號通路參與BPD是通過激活其下游基因LEF—1實(shí)現(xiàn)的。 6、MF可能是肺發(fā)育及BPD中LF的主要存在形式。 7、WNT/β—catenin信號通路的活化可能與MF