1、背景:
　　 子宮內(nèi)膜癌是常見的婦產(chǎn)科惡性腫瘤之一。2011年美國約有8，010名婦女死于子宮內(nèi)膜癌，有近47，130名患者新診斷為子宮內(nèi)膜癌。在所有子宮內(nèi)膜癌患者中，約70％的患者其子宮內(nèi)膜癌病灶局限于宮體，患者5年生存率高達85％。美國婦科腫瘤組單藥或聯(lián)合化療藥物臨床試驗（包括鉑類，紫杉醇類及蒽環(huán)類抗生素類等），晚期（FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期）和復發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者中僅有少數(shù)患者表現(xiàn)為對化療藥物有較好反應，患者臨床癥狀、體征，實

2、驗室檢查以及影像學檢查達到臨床完全緩解。雖然子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)聯(lián)合化療后緩解率提高，但患者無病進展生存期(PFS)較短，一般為5-7個月，而且病死率較高。這些臨床數(shù)據(jù)表明目前亟待開發(fā)新型有效子宮內(nèi)膜癌化療預防和治療藥物。
　　 天然食品是眾多化療藥物有效活性成份的重要來源之一，并對子宮內(nèi)膜癌和其他類型腫瘤起化療預防和治療作用。已有研究發(fā)現(xiàn)姜干粉或可溶性提取液能夠誘導皮膚癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌以及卵巢癌細胞系細胞周期停滯和凋亡

3、。在SENCAR小鼠腫瘤模型中，通過皮膚局部涂抹姜的乙醇萃取液可以降低DMBA/TPA誘導的皮膚腫瘤的發(fā)病率以及腫瘤大小和數(shù)量。
　　 已有研究顯示，姜干粉和可溶性提取液中起抗癌作用的主要生物活性成份是多聚酚類化合物，如4-、6-、8-、10-gingerols，paradol和shogaol。對不同腫瘤的體外和體內(nèi)研究顯示，多聚酚類化合物尤其是gingerols具有有效抗腫瘤細胞增生和抗腫瘤血管形成的特性。研究顯示，6-gin

4、gerol可以通過誘導CyclinD蛋白降解及激活β-catenin、PKCdelta和GSK3beta等信號通路的機制抑制人結直腸腫瘤細胞增生，誘導腫瘤細胞凋亡和G1期細胞周期停滯。姜有效活性成份shagaol可以通過抑制NF-κB激活以及降低VEGF和IL-8分泌的機制顯著抑制上皮性卵巢癌細胞系細胞增生。6-gingerol可以通過增加凋亡相關p53蛋白及其下游促凋亡蛋白Bax表達，同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達等機制誘導前列腺癌

5、細胞系LnCap細胞凋亡。
　　 提取姜有效活性成份的途徑主要有兩種。一種是通過干燥生姜的方法獲得姜干粉，另一種是通過加熱生姜的方法獲得姜的可溶性提取液。也有研究發(fā)現(xiàn)通過蒸汽蒸餾生姜根莖的方法也能夠獲得姜的有效生物活性成分。到目前為止對姜蒸汽蒸餾提取物抗癌特性的研究甚少。之前研究表明姜干粉和可溶性提取物中起抗癌作用的主要活性成份是多聚酚類化合物，而姜蒸氣蒸餾提取物的化學分析顯示姜蒸餾提取物中多聚酚類化合物含量極少。姜蒸汽蒸餾提取

6、物對有效抗癌成份及其作用機制有待研究。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在探討姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)的化學組成，有效抗腫瘤化學成份;姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)對子宮內(nèi)膜癌細胞增生的影響以及其抗癌作用機制。
　　 1.方法:
　　 1.1提取姜蒸汽蒸餾產(chǎn)物(SDGE)
　　 從供應商處購得生姜，用蒸餾水洗凈后將生姜切成0.5厘米大小塊狀。將250-300克姜轉移到1000毫升Clevenge

7、r水蒸汽蒸餾裝置的圓底燒瓶中，注入500毫升去離子水(18MOhm-cm)浸沒姜。持續(xù)加熱圓底燒瓶4-6小時。從clevenger裝置中分離的油狀混合物比水輕，可通過定期引流分離管中的液體來進行收集。通過離心分離得到上層淡黃色提取物(SDGE)后立即分裝在離心管中，-80℃冰箱保存實驗前取出。通過稱量SDGE質(zhì)量和體積計算出SDGE密度為0.87g/ml，這個數(shù)值用于換算提取物的濃度，方便之后生物學實驗的進行。
　　 1.2細胞

8、增殖實驗（MTT實驗）
　　 1.21四甲基偶氮唑鹽攝取法檢測SDGE、citral和6-gingerol對子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa和ECC-1細胞增生的影響。
　　 用培養(yǎng)基重懸細胞以5000個/孔的密度接種于96孔板。用不同濃度梯度SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml),citral(1.5μM、15μM、150μM)和6-gingero

9、l（1.5μM、15μM、150μM）處理細胞，細胞置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72小時后，每孔加入20μl3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，細胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中再孵育3小時。3小時后每孔中加入100μlDMSO溶液溶解甲瓚結晶。細胞培養(yǎng)板置于水平搖床上低速震蕩5分鐘。紫外分光光度計波長570nm處讀取吸光值OD。
　　 1.22SDGE聯(lián)合銫-13

10、7γ放射線照射或順鉑溶液處理細胞
　　 四甲基偶氮唑鹽攝取法（MTT實驗）檢測SDGE是否能夠加強放射線或化療試劑對子宮內(nèi)膜癌細胞的增生抑制作用。實驗第一天將Ishikawa或ECC-1細胞以5000個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板。細胞貼壁后，在細胞培養(yǎng)板中加入單純細胞培養(yǎng)基或2.5μg/mlSDGE溶液，細胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。實驗第三天，在一部分細胞培養(yǎng)孔中加入順鉑溶液（5μM）;另一部

11、分細胞培養(yǎng)孔用銫-137放射儀進行照射，單次照射劑量為4Gy。細胞培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時。用四甲基偶氮唑鹽攝取法檢測不同處理條件對子宮內(nèi)膜癌細胞增生的影響，實驗步驟如上。
　　 1.3氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術分析SDGE化學組成
　　 用GC-17A氣相色譜儀及QP-5000四極質(zhì)譜分析儀(Shimadzu公司)分析SDGE化學組成。分析前將20μl新鮮解凍的SDGE樣品加入到1

12、000μl戊烷中進行稀釋。吸取1μl稀釋后的SDGE樣品注入氣相色譜儀。設置GC-MS參數(shù)，分流比:1∶50;氦氣流速:1.4ml/min。設置GC-MS內(nèi)非極性RTX-5MS柱（長30米，內(nèi)徑0.25毫米，膜厚0.25微米）柱起始溫度為70℃，以4℃/min速度加熱至180℃后維持。設置GC-MS電離檢測方式為全掃描，陽離子模式質(zhì)荷比(m/z)范圍:41-300。實驗結束后通過搜索美國國家標準技術研究所（NIST圖書館）將獲得的數(shù)據(jù)與

13、Adams算術保留指數(shù)值進行對比進而鑒別SDGE的化合物組成。
　　 1.4細胞凋亡實驗
　　 用FITC-AnnexinV流式細胞實驗方法（BD公司凋亡檢測試劑盒）檢測細胞凋亡。方法如下:在2×106個細胞中加入0.25μg/mlSDGE和或100μMPifithrin-α，細胞培養(yǎng)瓶置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0-16小時。用胰酶進行消化，收集細胞后用冷PBS緩沖液沖洗2遍，用1×結合緩沖液(10mMHEP

14、ES/NaOH，pH7.4，140mMNaCl，2.5mMCaCl2)重懸制成1×106個/ml細胞懸液。將100μl細胞懸液（1×105個細胞）轉移至5ml流式管中，加入5μlFITC-AnnexinV和5μlpropidiumiodide(PI)進行染色，輕輕渦旋震蕩后，室溫避光孵育15分鐘。1×結合緩沖液洗細胞一次，用500μl1×結合緩沖液重懸。將細胞置于冰上避光，用FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。流式細胞實驗結果用F

15、lowJo軟件進行分析。
　　 1.5細胞周期實驗
　　 用不同濃度SDGE（250ng/ml或2.5μg/ml）處理子宮內(nèi)膜癌細胞24、48和72小時后，胰酶消化收集細胞。PBS緩沖液洗后重懸，渦旋震蕩同時逐滴加入75％乙醇進行固定。PBS緩沖液洗細胞后加入propidiumiodide(PI)進行染色。流式細胞儀檢測細胞周期狀態(tài)，步驟如上，流式細胞實驗結果用FlowJo軟件進行分析。
　　 1.6蛋白質(zhì)印跡實

16、驗
　　 用250ng/mlSDGE處理細胞特定時間后收集細胞，冷PBS緩沖液沖洗，離心去掉上清，往細胞沉淀中加入RIPA緩沖液（Pierce公司）進行細胞裂解，裂解液中加入蛋白酶抑制劑cocktail（Thermo公司）。超聲裂解細胞后離心收集上清，BCA實驗方法測定蛋白質(zhì)濃度。取25μg蛋白質(zhì)樣品加入聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中。7.5或12％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電泳結束后將分離蛋白轉到PVDF膜上。PVDF膜用含5％

17、脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉一小時，特異性一抗孵育過夜。第二天用TBST緩沖液洗膜3次后，過氧化物酶結合二抗孵育1小時。TBST緩沖液洗膜3次后用WestDura或WestFemto化學發(fā)光試劑盒（Thermo公司）進行顯色。應用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片。實驗結果用ImageJ軟件進行定量分析。
　　 1.7線粒體膜電位分析
　　 將子宮內(nèi)膜癌細胞接種在T25細胞培養(yǎng)瓶中。細胞指數(shù)生長期內(nèi)，在細胞培養(yǎng)基中加入0.02

18、5μg/ml或0.25μg/mlSDGE;對照組加入等量DMSO。細胞培養(yǎng)瓶置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。用PBS緩沖液洗細胞后胰酶消化收集細胞，制成1×106個/ml細胞懸液。將100μl細胞懸液（1×106個細胞）轉移至5ml流式管中，加入40nMDiOC637℃孵育30分鐘。洗細胞后用含2％FBSPBS緩沖液400μl重懸。FACSCALIBUR流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化。實驗結果用FlowJo軟件進行分析。

19、
　　 1.8鈣離子內(nèi)流實驗分析
　　 胰酶消化收集對數(shù)生長期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞。用PBS緩沖液洗滌3次后，用含0.5％BSA培養(yǎng)基重懸，使細胞密度為1×107/ml。向1×107/ml細胞懸液中加入2mMIndo1-AM和4mMprobenecid，置于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，用含1mMCaCl2的0.5％BSADPBS緩沖液重懸，使細胞密度為2×106/ml。用

20、35微米濾器過濾細胞，并保持細胞在37℃。流式細胞儀進行分析時，初始3分鐘檢測細胞內(nèi)基礎鈣離子濃度，然后各試管中分別加入0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/mlSDGE或1μMIonomycin繼續(xù)上機檢測7分鐘，觀察記錄鈣離子流量變化。實驗結果用FlowJo軟件進行分析。
　　 1.9統(tǒng)計分析
　　 采用單樣本T檢驗，P≤0.05被認為有顯著性差異。數(shù)據(jù)分析用GraphPadPrizm軟件。
　

21、　 2結果
　　 2.1蒸汽蒸餾實驗從姜中提取姜蒸汽蒸餾產(chǎn)物(SDGE)
　　 通過改良Clevenger水蒸汽蒸餾裝置我們可以方便地從姜中提取出SDGE，從250克姜中可以提取出大約300毫克精油。我們先后用五批姜提取SDGE。其中兩批是從印度不巴內(nèi)什瓦爾購買，在當?shù)貙嶒炇彝ㄟ^蒸汽蒸餾方法提取SDGE。其余三批是從美國威斯康辛州購買，在威斯康辛大學實驗室提取SDGE。這五批姜提取的SDGE產(chǎn)量大致相同，通過計算SDG

22、E密度約為0.8g/L。
　　 2.2姜蒸汽蒸餾提取物(SDGE)是有效的子宮內(nèi)膜癌細胞增生抑制劑
　　 首先檢測SDGE對子宮內(nèi)膜癌細胞系ECC-1和Ishikawa細胞增生的影響。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，SDGE低濃度250ng/ml時兩種子宮內(nèi)膜癌細胞增生即受抑制（圖1A、B）;SDGE高濃度2.5μg/ml時，兩種子宮內(nèi)膜癌細胞增生顯著受到抑制(P＜0.05)。圖1A、B中實驗結果是3次獨立MTT實驗數(shù)據(jù)的累計，實驗用S

23、DGE來自3個不同產(chǎn)地。在實驗中SDGE每個濃度設有16個復孔。因此圖1中每點是48個獨立數(shù)據(jù)的平均值。實驗結果僅有微小的差異，可重復性高，能清楚地說明SDGE對子宮內(nèi)膜癌細胞系ECC-1和Ishikawa細胞增生的影響。MTT實驗顯示72小時，SDGE對兩種細胞的半數(shù)抑制濃度IC50約為1.25μg/ml。
　　 2.3SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線照射或順鉑試劑加強對子宮內(nèi)膜癌細胞的增生抑制作用
　　 晚期（FIGO

24、分期Ⅲ、Ⅳ期）和復發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的處理原則是放療和化療。因此我們進一步分析SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線照射或順鉑試劑是否能夠加強對子宮內(nèi)膜癌細胞的增生抑制作用。MTT實驗結果顯示:SDGE對兩種子宮內(nèi)膜癌細胞系的增生抑制率為40％;SDGE對ECC-1細胞增生抑制率與銫-137γ放射線照射對兩種細胞的增生抑制率相同（圖1C、D）;而Ishikawa細胞，SDGE對Ishikawa細胞的增生抑制率比銫-137γ放射線照射對Ishikaw

25、a細胞的增生抑制率高10％（圖1C），SDGE比銫-137γ放射線照射更有效抑制Ishikawa細胞增生;對兩種子宮內(nèi)膜癌細胞系ECC-1和Ishikawa細胞，SDGE聯(lián)合銫-137γ放射線照射對細胞增生抑制率比單獨銫-137γ放射線照射對細胞的增生抑制率高23-25％（圖1C、D），說明SDGE加強銫-137γ放射線照射對子宮內(nèi)膜癌細胞的增生抑制作用。
　　 我們進一步分析了SDGE聯(lián)合順鉑試劑對Ishikawa和ECC1細

26、胞增生的影響。MTT實驗結果顯示:Ishikawa細胞，72小時SDGE聯(lián)合順鉑試劑對細胞的增生抑制率比單獨順鉑處理對細胞增生抑制率高26％（圖1E）;而ECC-1細胞，SDGE聯(lián)合順鉑試劑與順鉑單獨對細胞的增生抑制率相同（圖1F）。
　　 通過MTT實驗我們還比較了SDGE與順鉑的細胞毒性。與對照組相比，順鉑（5μM;1.5μg/ml）對Ishikawa細胞和ECC-1細胞的增生抑制率分別為59％和61％（圖1E、F）。而SD

27、GE（2.5μg/ml）對Ishikawa和ECC-1細胞的增生抑制率分別為37％和42％（圖1E、F）。這些數(shù)據(jù)提示，SDGE與順鉑有相同有效抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增生的作用，為進一步研究SDGE抗癌機制提供有力的依據(jù)。
　　 2.4SDGE誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡
　　 MTT實驗顯示SDGE是一種有效的子宮內(nèi)膜癌細胞增生抑制劑。細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細胞增生降低是SDGE直接誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的結果。流式細胞實驗

28、顯示，用低濃度SDGE(250ng/mL)處理細胞后，細胞表面AnnexinV和PI染色增加（圖2A）。在細胞培養(yǎng)基中加入SDGE后，最早在30分鐘即能觀察到FITC-AnnexinV染色陽性細胞數(shù)增加（圖2A）。蛋白印跡實驗證實，用SDGE(250ng/ml)處理ECC-1（數(shù)據(jù)未顯示）和Ishikawa細胞24，48和72小時后，裂解caspase-3蛋白表達增加（圖2B）。我們進一步檢測SDGE對子宮內(nèi)膜癌細胞周期狀態(tài)的影響。用S

29、DGE（250ng/ml或2.5μg/ml）處理Ishikawa細胞24，48和72小時后，細胞用PI進行染色，流式細胞儀檢測細胞周期狀態(tài)改變（圖2C）。流式細胞實驗分析顯示，SDGE對細胞周期狀態(tài)沒有造成顯著的影響，僅觀察到細胞周期中S期細胞比例輕微降低。而且僅在高濃度SDGE2.5μg/ml處理Ishikawa細胞時觀察到。而低濃度250ng/mlSDGE處理細胞時，細胞周期狀態(tài)沒有任何改變，即便這個濃度已經(jīng)能誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡

30、。
　　 2.5SDGE的化學組成
　　 SDGE誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的特性促使我們進一步研究SDGE的化學組成以及其中起抗癌作用的有效生物活性成份。我們用氣象色譜-質(zhì)譜技術(GC-MS)對三批不同產(chǎn)地SDGE進行分析。戊烷稀釋SDGE后，揮發(fā)成分在通過非極性RTX-5MS色譜柱時得到分離（圖3），色譜流出曲線上的各個峰所代表的成分通過電子離子質(zhì)譜儀進行鑒定。通過分析色譜流出曲線上每個峰的滯留時間，峰面積或峰高值，可以

31、鑒定SDGE的化學組成及各成份所占比例。我們總共從SDGE中鑒別出22種化合物及其相對含量（表1）。數(shù)據(jù)分析顯示從不同產(chǎn)地姜提取的SDGE化學組成基本一致。
　　 氣象色譜-質(zhì)譜技術分析結果顯示，SDGE中不含多聚酚類化合物，如gingerol，shogaol和paradol等。而在之前的研究中已經(jīng)報道，姜干粉和可溶性提取液中的有效抗癌活性成份正是這些多聚酚類化合物[20，24，25，36]。因此我們用純化的6-gingerol

32、進行MTT實驗檢測其對子宮內(nèi)膜癌細胞增生的影響。MTT實驗顯示即便在高濃度150μM時，6-gingerol仍不能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增生（圖4A和4B）。6-gingerol的MTT實驗結果進一步支持我們的GC-MS分析。
　　 氣象色譜-質(zhì)譜分析結果顯示，SDGE的主要組成成份是類萜類化合物。而citral，是Neral和geranial兩種類萜異構體的混合物，占到SDGE化合物組成的35-45％（表1）。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，

33、citral能顯著降低Ishikawa和ECC-1細胞增生。Citral對兩種細胞的半數(shù)抑制摩爾濃度IC50約為15-25μM(圖4C和4D)。Citral的半數(shù)抑制濃度IC50約為2.28-3.8μg/ml。而SDGE有效的IC50為1.25μg/ml，因neral和geranial僅占SDGE組成的35-45％，因此SDGE的IC50相當于citral2.8-3.7μM。這個濃度要顯著低于MTT實驗得出的citral半數(shù)抑制濃度15

34、-25μM（圖4C和4D）。因此我們得出以下結論，在SDGE中除外citral，還有其他的類萜類化合物也貢獻了顯著的抗癌作用。在接下來的研究中，我們?nèi)园裇DGE而非citral作為機制研究的主要對象。
　　 2.6SDGE誘導細胞內(nèi)鈣離子流量增加，線粒體膜電位下降
　　 用SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml)處理Ishikawa細胞后，細胞內(nèi)鈣離子流量顯著增加(圖5A)。在Ishikaw

35、a細胞中加入SDGE初始3分鐘后即可以觀察到細胞內(nèi)鈣離子流量增加。鈣離子通量的時間動力學曲線形態(tài)與ionomycin（1μM）的時間動力學曲線形態(tài)相似。細胞內(nèi)鈣離子流量與SDGE濃度成正比。實驗顯示SDGE(2.5μg/ml)誘導的細胞內(nèi)鈣離子流量峰值是ionomycin（1μM）鈣流量峰值的60-70％。在細胞中加入Ionomycin后細胞內(nèi)鈣離子流量急劇增加，在一分鐘內(nèi)迅速降低。而SDGE(0.025μg/ml、0.25μg/ml、

36、2.5μg/ml)誘導的細胞內(nèi)鈣離子流量增加以及下降相對緩慢(圖5A)。細胞中加入SDGE之后5-6分鐘細胞內(nèi)鈣離子流量下降但仍高于初始3分鐘基線鈣離子水平(圖5A)。
　　 在子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa培養(yǎng)基中加入SDGE后，細胞內(nèi)鈣離子流量增加，細胞凋亡誘導增加，說明線粒體功能發(fā)生缺陷。我們進一步用流式細胞實驗檢測線粒體膜電位改變，實驗結果顯示用SDGE（25ng/ml或250ng/ml）處理Ishikawa細胞后，細胞

37、線粒體膜電位降低兩倍（圖5B）。
　　 2.7SDGE誘導Bax/Bcl-2比值增加
　　 Bcl-2是一種線粒體外膜相關抗凋亡蛋白。實驗顯示SDGE處理Ishikawa細胞后，細胞線粒體膜電位下降。促使我們進一步研究SDGE對子宮內(nèi)膜癌細胞Bcl-2蛋白表達的影響。我們用SDGE(250ng/ml)處理子Ishikawa細胞特定時間，實驗結果顯示24，48和72小時后Ishikawa細胞Bcl-2蛋白表達降低，而促凋亡

38、Bax蛋白表達沒有明顯改變，Bax/Bcl-2比值增加1.3-2.0倍(圖6A)，ECC-1數(shù)據(jù)未顯示。
　　 2.8SDGE激活p53信號通路
　　 p53腫瘤抑癌基因是一個轉錄因子，在調(diào)控細胞死亡和各種細胞程序中起關鍵作用。p53參與調(diào)控的細胞事件包括細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復以及衰老等。實驗顯示SDGE能夠誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，因此我們進一步研究SDGE對p53蛋白的影響。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，SDGE(2

39、50ng/ml)處理Ishikawa細胞后，p53蛋白15位絲氨酸磷酸化迅速增加(圖6B)，說明p53被激活。
　　 pifithrin-α是一種特異性p53蛋白抑制劑[37]。用pifithrin-α預處理Ishikawa細胞后，流式細胞實驗顯示SDGE(250ng/ml)誘導的子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡完全被抑制（圖6C）。對照組中細胞FITC-AnnexinV染色陽性率約為11％（細胞培養(yǎng)基中不加入SDGE或pifithrin-α

40、）;SDGE處理組細胞FITC-AnnexinV染色陽性率約為39.5％;pifithrin-α預處理組細胞FITC-AnnexinV染色陽性率約為10％。細胞凋亡實驗進一步證實，SDGE誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡是通過激活p53信號通路。
　　 2.9SDGE不能誘導p53negSKOV3細胞凋亡
　　 有研究報道卵巢癌SKOV-3細胞系不表達p53蛋白。因此我們采用SKOV3細胞研究在無p53蛋白存在情況下，SDGE對細

41、胞凋亡的影響。流式細胞實驗顯示，用SDGE(250ng/ml)處理SKOV-3細胞30分鐘，2、4和16小時后，細胞表面FITC-AnnexinV染色率沒有改變，SKOV3細胞無凋亡發(fā)生（圖6D）。我們進一步用蛋白質(zhì)印跡實驗證實SDGE處理SKOV-3細胞未發(fā)生凋亡，實驗顯示SDGE處理后細胞無裂解caspase3蛋白表達（圖6E）。
　　 3.結論:
　　 (1)SDGE主要組成成份是22種類萜類化合物。SDGE可通過