1、第一部分、紅豆杉中新紫杉烷類二萜類化合物體外抗人子宮內(nèi)膜癌活性篩選子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤，盡管子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及治療方法取得了很大進展，但其年發(fā)病率及死亡率仍在不斷升高。藥物治療已成為復(fù)發(fā)性內(nèi)膜癌的主要治療方式。植物源性藥物在多種疾病尤其是癌癥的治療中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，從太平洋紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中分離得到的紫杉醇(Taxol)是臨床上最為重要的抗癌制劑。由于紫杉醇是從太平洋紅豆杉的樹皮中分離得

2、到的，而太平洋紅豆杉生長速度慢，樹皮中紫杉醇含量低，一旦剝離樹皮樹木也難以生存，大大限制了紫杉醇的開發(fā)利用。因此亟待尋找具有較低毒副作用、較高抗腫瘤選擇性及對多種腫瘤細胞尤其是對有抗藥性的人體腫瘤細胞有較高生物活性的紫杉烷類化合物。
　　 目的:為尋找活性強、毒副作用小的化合物，本研究對紅豆杉可再生針葉中提取純化得到的48種非紫杉醇二萜類化合物為對象，對人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖抑制活性進行了篩選，這對于擴大植物藥源，尋找和開發(fā)新的抗

3、癌先導(dǎo)化合物或藥物都具有重要意義。
　　 方法:應(yīng)用MTT比色法進行活性篩選。細胞接種于96孔板，每孔含1×104個細胞，分別加入溶劑對照（終濃度0.1％ DMSO）、陽性對照紫杉醇和終濃度為100μmol/L各種實驗用化合物，每組設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL MTT。實驗終止測定各孔吸光度值(OD值)，測定波長入=570 nm，參考波長入=630

4、 nm，并計算細胞存活率。細胞存活率(％)=（給藥組OD值/對照組OD值）×100;計算實驗用化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
　　 結(jié)果:48種紫杉烷類化合物抑制人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1的增殖活性的篩選結(jié)果為:18種紫杉烷類化合物對HEC-1細胞增殖的抑制活性極顯著高于對照組(P＜0.01)。當(dāng)用100μmol/L10-deacetyl-13-oxobaccatinⅢ(1),13-oxobaccatinⅢ(2), bac

5、catinⅢ(3),9-dihydro-13-acetyl-baccatinⅢ(4)處理HEC-1細胞48 h后腫瘤細胞的存活率分別為48.94％、40.17％、22.51％和28.34％;100μmol/L7-epi-10-deacetyltaxol(5),7,13-dideacetyl-9,10-didebenzoyl-taxchinin C(6),10β-hydroxy-2α,9α,13α-triacetoxy-5α-cinnam

6、atetaxa-4(20),11-diene(10)和7β,9α-dideacetyl-5-decinnamoyl-taxinine J(11)處理HEC-1細胞48 h后腫瘤細胞的存活率分別為6.00％、72.85％、10.52％和19.97％;當(dāng)用100μmol/L11-diene(12)、10-deacetyltaxinine(17)、9,10-deacetyltaxinine(19)和taxagifin(25)處理HEC-1細胞

7、時，細胞存活率分別為12.91％、33.80％、8.78％和25.33％;當(dāng)用100μmol/L taxezopidine J(27)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)、2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)和taxachitriene A(32)處理HEC-1時，細胞存活率分別為:19.85％、7.64％、4.61％和67.00％;

8、當(dāng)用100μmol/L5α-cinnamoyloxytaxin B(37)和5α，10β,13α-triacetoxytax-11-ene-2α，7β，9α，20-tetraol(44)作用HEC-1細胞時，存活率分別為42.15％和49.37％。其中，化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)對HEC-1細胞增殖的抑制活性高于紫杉醇，五種化合物對HEC-1細胞的IC50值分別為0.15μmol/L、3.75μmol/L、4.

9、91μmol/L、1.08μmol/L和3.96μmol/L，化合物(5)和(29)的IC50值低于紫杉醇。
　　 結(jié)論:從紅豆杉科植物的針葉中提取的化合物(5)、(10)、(19)、(29)和(30)五種非紫杉醇二萜類化合物對人子宮內(nèi)膜癌細胞具有較強的增殖抑制活性。
　　 第二部分、新紫杉烷類化合物構(gòu)-效關(guān)系研究紫杉烷類化合物是從植物中得到的一大類天然產(chǎn)物，在結(jié)構(gòu)分類上屬于二萜類，故又稱之為紫杉烷二萜。紫杉醇(Taxo

10、l)是從紅豆杉屬（Taxus）植物中分離得到的紫杉烷二萜成分，其顯著的抗腫瘤活性和獨特的作用機理令世人囑目。盡管紫杉醇的臨床應(yīng)用廣泛且取得了巨大成功，但仍存在藥物溶解性低、毒副作用大、耐藥現(xiàn)象等諸多問題，因此對其構(gòu)效關(guān)系及結(jié)構(gòu)改造的探討已成為當(dāng)今研究的熱點，以期找到天然結(jié)構(gòu)更簡單、活性更強的類似物或替代分子。
　　 目的:為系統(tǒng)分析紫杉烷類化合物抗腫瘤活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，將從紅豆杉分離提取的48種紫杉烷類化合物依據(jù)其母核及

11、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進行分組，研究了其對子宮內(nèi)膜癌細胞及其他婦科腫瘤細胞增殖抑制活性的影響，以期為紫杉烷類化合物的開發(fā)和利用提供合成實驗的依據(jù)。
　　 方法:將48種紫杉烷類化合物按結(jié)構(gòu)分為四組:1、具有4，5，20-oxetanring結(jié)構(gòu)的非紫杉醇二萜類化合物（化合物1-7）;2、具有C-4，20 doublebond結(jié)構(gòu)的非紫杉醇二萜類化合物（化合物8-22）;3、具有12，16-Epoxytaxanes結(jié)構(gòu)（化合物23-26）、13

12、，16-Epoxytaxanes結(jié)構(gòu)（化合物27）、C-4，20 double bond oxygenated結(jié)構(gòu)（化合物43-45）、C-4，20 doublebond with C-12，17-epoxide結(jié)構(gòu)（化合物46）及C-11，12 seco-taxane with C4，20 double bond結(jié)構(gòu)（化合物47）的非紫杉醇二萜類化合物;4、具有3，11-cyclotaxanes結(jié)構(gòu)（化合物28-30）和Bicycli

13、c Taxoids結(jié)構(gòu)(化合物31-33)及2(3→20)abeotaxanes結(jié)構(gòu)（化合物34-42）的非紫杉醇二萜類化合物，應(yīng)用MTT比色法（與第一部分相同）進行活性篩選。
　　 結(jié)果:具有4，5，20-oxetan ring結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物中1位碳原子連接較大取代基的化合物抗腫瘤活性較低，抗腫瘤活性隨羥基取代基數(shù)目的增加而增加;具有6/8/6母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物的抗腫瘤活性與C-5位連有的肉桂?；鶄?cè)鏈有一定的相關(guān)性

14、;具有3，11-cyclotaxanes母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物抗腫瘤活性較強;具有2(3→20) abeotaxanes和bicyclictaxoids母核結(jié)構(gòu)的紫杉烷類化合物均顯示較弱的抗腫瘤活性;化合物(29)具有與紫杉醇極為相似的最小能量化三維立體構(gòu)象;紫杉烷類化合物(5)，(10)，(19)，(29)和(30)具有廣譜抗腫瘤活性。
　　 結(jié)論:抗人子宮內(nèi)膜癌細胞活性不僅與紫杉烷類化合物的骨架結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而且該類化合物

15、抗人子宮內(nèi)膜癌細胞活性可能還與C-5位具有的肉桂?；鶄?cè)鏈以及化合物含有的羥基側(cè)鏈的數(shù)目有一定的相關(guān)性;紅豆杉中純化的非紫杉烷化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、10β-hydroxy-2α，9α，13α-triacetoxy-5α-cinnama-tetaxa-4(20),11-diene(10)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2α,10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phot

16、otaxicinⅡ(29)和2α,9α-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(30)不僅對人子宮內(nèi)膜癌細胞具有較強的抑制活性，而且對其他實驗婦科腫瘤細胞同樣具有較強的抑制活性。
　　 第三部分、9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧抗子宮內(nèi)膜癌作用機制研究癌癥治療的主要目的是選擇性摧毀腫瘤細胞。具細胞毒性的抗癌藥物可造成不可修復(fù)的DNA損傷，引發(fā)細胞凋亡，最終造成腫瘤細胞死亡。常用化療藥物抗腫瘤治療的機

17、制與誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)。天然植物產(chǎn)物是抗癌活性成分的重要來源，這些成分多通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮作用。
　　 目的:前期研究發(fā)現(xiàn)從紅豆杉針葉中分離提取的化合物(29)即9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖具有明顯的抑制活性，本實驗進一步分析了化合物(29)對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡及凋亡信號通路中重要蛋白表達量的影響，以期明確其抗癌機制。
　　 方法:1.TUNEL法觀察細胞凋亡情況?；衔?29)終濃度為10μm

18、ol/L處理HEC-1細胞，24 h后棄去培養(yǎng)液，用TUNEL檢測試劑盒檢測，熒光顯微鏡下，觀察，拍照。2.流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察化合物(29)作用HEC-1細胞后的凋亡情況。細胞傳代進入對數(shù)生長期，隨機分組，實驗組加入10μmol/L的化合物(29)，空白對照組加入DMSO，于培養(yǎng)48 h后收集細胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)整其濃度為1×106/mL，取100

19、μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μL的PI溶液(20μg/mL)，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400μL稀釋好的結(jié)合緩沖液，及時上流式細胞儀分析。每次實驗重復(fù)3次。3.Western Blotting技術(shù)觀察化合物(29)作用子宮內(nèi)膜癌細胞后4種蛋白因子p53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達變化情況。用直徑100 mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)HEC-1細胞，1×106個

20、，三枚加入化合物(29)，終濃度為2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L，一枚加入順鉑，終濃度為20μmol/L，一枚為對照組?；衔镒饔萌俗訉m內(nèi)膜癌細胞48 h后，收集全細胞。裂解細胞后，聚丙烯凝膠電泳，牛奶封閉，轉(zhuǎn)膜，依次與一抗和二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影。4.利用MTT法檢測了半胱天冬酶抑制劑對化合物(29)抑制人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用。使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L的化合物(29)處理

21、HEC-1細胞，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育48h后，MTT法測定OD值。5.利用MTT法檢測了半胱天冬酶抑制劑對化合物(29)抑制其他婦科腫瘤細胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用。使用5μmol/L的化合物(29)分別處理人宮頸癌細胞HeLa、人卵巢透明囊腺癌細胞(SHIN3和HOC-21)及人透明癌細胞HAC-2，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育48 h后，MTT法測定OD值。6.Wes

22、tern Blotting技術(shù)觀察化合物(29)作用子宮內(nèi)膜癌細胞后HSP90α的表達變化情況，具體方法同3.。
　　 結(jié)果:
　　 1.TUNEL染色顯示，經(jīng)化合物(29)作用24 h后的HEC-1細胞出現(xiàn)凋亡信號。
　　 2.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，10μmol/L的化合物(29)處理HEC-1細胞24 h后細胞早期凋亡率為31.7％，而對照組僅為4.7％。
　　 3.化合物(29)可顯著誘導(dǎo)HEC-

23、1細胞內(nèi)的p53、Bax和caspase-3蛋白表達上調(diào)，p53及Bax的表達量隨藥物濃度增加而增加，在處理24 h時p53表達量最高，化合物(29)各劑量組的Bax/Bcl-2的比值均顯著高于空白對照組(P＜0.05)，5μmol/L及10μmol/L處理組出現(xiàn)caspase-3活化片段。
　　 4.使用0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L化合物(29)處理HEC-1細胞，其細胞生存率分別為67.13％、35.

24、41％和1.87％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與化合物(29)共同孵育HEC-1細胞后，其細胞生存率分別上升為83.11％、40.15％和6.53％，且20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉(zhuǎn)1μmol/L和10μmol/L化合物(29)對HEC-1細胞增殖的抑制活性（P＜0.05）。
　　 5.20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉(zhuǎn)5μmol/L化合物(29)對HOC-21及HAC-2細胞增殖的抑制活性（

25、P＜0.05）。6.化合物(29)處理HEC-1細胞后胞內(nèi)HSP90α蛋白表達量降低，且10μmol/L處理組HSP90α的表達水平極顯著低于對照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧(29)通過誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　 2.9-去乙酰-3，11-環(huán)化紫杉寧(29)對人子宮內(nèi)膜癌的抗瘤活性機制與紫杉醇不同。
　　 3.9-去乙酰-3