1、目的:神經(jīng)保護(hù)藥物是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要治療方法,具有極為廣闊的開發(fā)與應(yīng)用空間,現(xiàn)已證明證明鈣拮抗劑尼莫地平對于急性缺血性腦血管病的死亡率無明顯改善。替拉扎特治療組卒中的隨機對照的臨床試驗由于缺乏效果已被提前停止。氧自由基清除劑依達(dá)拉奉尚沒有足夠的臨床試驗證明其神經(jīng)保護(hù)作用,目前人類已將眾多中藥應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究,目前尚缺乏證據(jù)證明其臨床有效性,人類仍在積極地致力于神經(jīng)保護(hù)藥物的開發(fā)與研究,在自然界中尋找具有神經(jīng)保護(hù)作用的化

2、合物是開發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用藥物的重要方法,萜類化合物是一大類植物次生產(chǎn)物的總稱,研究顯示萜類化合物具有神經(jīng)保護(hù)作用,如樟芝(樟菇,最貴的蘑菇)中提取的五種二萜類化合物,在在體研究中適當(dāng)濃度時表現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)作用。紫杉醇是最初自紅豆杉樹皮中提取的一類復(fù)雜的二萜類化合物,具有含氧四環(huán)的紫杉烷環(huán)及酯側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。人們對其抗腫瘤作用及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了深入、廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)有些化合物與抗腫瘤作用并無關(guān)聯(lián),本實驗從具有某些結(jié)構(gòu)特征的紫杉烷化合物中篩選具有

3、抗氧化應(yīng)激作用研究的化合物并對其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究。
　　 實驗一氧化應(yīng)激模型的建立
　　 目的:應(yīng)用H2O2處理SK-N-SH細(xì)胞建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。
　　 方法:取對數(shù)生長期SK-N-SH細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,分4組接種于96孔培養(yǎng)板,每組三個復(fù)孔,每孔100μL,37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng),12小時后,加入100μL不同濃度H2O2,使各組H2O2終濃度分別為0、50、100、150μ

4、mol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。
　　 結(jié)論:H2O2對SK-N-SH細(xì)胞具有損傷作用,在50-150μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系,150μmol/L H2O2處理24h后細(xì)胞活力為26.1±1.1％,因此將此濃度作為建立細(xì)胞模型濃度。
　　 實驗二篩選具有抗氧化應(yīng)激活性的紫杉烷化合物
　　 目的:篩選具有抗氧化應(yīng)激作用的紫杉烷類化合物,并分析其構(gòu)效關(guān)系。
　　

5、方法:實驗分為空白對照組、陰性對照組、處理組、陽性對照組、正常對照組。取對數(shù)生長期Sk-N-Sh細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,分別接種于96孔培養(yǎng)板,每孔160μL,37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng),12小時后,各組細(xì)胞加入不同試劑?？瞻讓φ战M:每孔加入40μL PBS;陰性對照組:每孔加入20μL1640培養(yǎng)基,2小時后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L;處理組:包括Taxine

6、 B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A每種藥物三個濃度組,共12個亞組,每亞組三復(fù)孔。每孔加入20μL不同種類、濃度的化合物,2小時后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,藥物終濃度為1、10和100μmol/L;陽性對照組:每孔加入20μL表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epig

7、allocatechin Gallatte,E G C G)(100μmol/L),2小時后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,EGCG終濃度為10μmol/L;正常對照組分別加入20μL PBS和20μL濃度為1mmol/L的7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine

8、使四種紫杉烷化合物終濃度均為100μmol/L,共4個亞組。各組細(xì)胞處理24小時后MTT法檢測細(xì)胞活力,HO熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。
　　 結(jié)論:本實驗選用的四種化合物Taxine B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A均為自紫杉中提取的紫杉烷類化合物,擁有共同的母環(huán)結(jié)構(gòu),具有共同的特點本試驗化合物C13位乙酰基取

9、代長側(cè)鏈,C1位羥基消失,C2位乙?；媪吮郊柞；?C4位乙?；?C5位的羥基導(dǎo)致氧丁環(huán)消失。他們的區(qū)別在于:Taxine B在C5位上含有羥基,C7位上含有乙?；?7-Deacetyl-taxine B C5、C7位上含有羥基;5-Cinnamoyloxy-taxin B在C7位上含有乙酰基,C5位上含有脂溶性側(cè)鏈;7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A在C7位上含有乙?；?C5位含有堿性性長鏈基團(tuán)。<

10、br>　　 結(jié)果表明經(jīng)修飾后的紫杉烷并未表現(xiàn)抗腫瘤作用,可能與他們共同的結(jié)構(gòu)特點有關(guān):C13位取代側(cè)鏈,C1位取代了羥基,C2位代之以乙?；?C4位乙?；?C5位代之以羥基導(dǎo)致氧丁環(huán)消失。
　　 7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物不僅細(xì)胞毒性消失,并且使氧化應(yīng)激細(xì)胞模型細(xì)胞活力顯著提高,表現(xiàn)了抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護(hù)作用。其中7-Deacetyl-taxine B抗氧化應(yīng)

11、激作用強于5-Cinnamoyloxy-taxin B,Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A較對陰性對照比較無顯著性差異。7-Deacetyl-taxine B的抗氧化應(yīng)激作用最強,可能由于此化合物5、7位上相鄰羥基的穩(wěn)定苯氧自由基結(jié)構(gòu)的作用導(dǎo)致了抗氧化應(yīng)激作用的增強。
　　 本實驗SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)H2O2處理24h后,Hoechst染色顯示陰性組顯示大量細(xì)胞染色質(zhì)凝聚;100μ

12、mol/L7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、10μLmol/L EGCG處理后染色質(zhì)凝聚細(xì)胞較陰性對照組明顯較少,Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A處理后減少不明顯。化合物的抗氧化應(yīng)激作用可能與阻止細(xì)胞質(zhì)凝集,減少細(xì)胞染色質(zhì)損傷有關(guān)。
　　 實驗三、紫杉烷化合物對于H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷保護(hù)的機制研究
　　 目的:探討紫

13、杉烷類化合物抗氧化應(yīng)激神經(jīng)保護(hù)作用的機制。
　　 方法:實驗分為陰性對照組和處理組,每組包含3個復(fù)孔,每孔加入160μL細(xì)胞濃度為1×105/mL的對數(shù)生長期細(xì)胞,細(xì)胞在37℃、5％CO2,飽和濕度下培養(yǎng),12小時后給予藥物干預(yù)。
　　 對照組:每孔加入20μL1640培養(yǎng)基,2小時后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L。
　　 處理組:包括7-Deacetyl-ta

14、xine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B兩組,每組三復(fù)孔。每孔加入20μL不同種類的化合物,2小時后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,藥物終濃度為100μmol/L。各組細(xì)胞處理24小時后,透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變,流式細(xì)胞術(shù)觀察其細(xì)胞凋亡率的變化、細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量和細(xì)胞線粒體膜電位的變化。
　　 結(jié)論:
　　 1、H2O2可使SK-N-SH細(xì)胞的

15、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,染色質(zhì)固縮、濃染、邊集,細(xì)胞小體形成,H2O2的氧化應(yīng)激損傷與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 2、應(yīng)用紫杉烷類化合物7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物處理氧化應(yīng)激細(xì)胞模型可使細(xì)胞凋亡率明顯減少,存活率提高,線粒體腫脹減輕,線粒體膜電位明顯提高,說明紫杉烷化合物的抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護(hù)作用可能與保護(hù)線粒體、減少凋亡有關(guān)。
　　 3、應(yīng)用紫杉烷類化合物7-D