1、背景與目的：
　　 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,是原發(fā)性肝癌最常見的一種組織學(xué)類型。在我國,肝癌死亡率已占惡性腫瘤的第二位,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。肝癌的發(fā)生是一個復(fù)雜的多病因、多階段、多因素參與的過程,其中抑癌基因的突變?nèi)笔?、癌基因的異常擴增與表達、多基因網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控異常決定最終腫瘤表型的表達。在我國,慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,H

2、BV)感染是導(dǎo)致肝硬化和肝癌發(fā)生的主要因為,在這一過程中涉及多基因的異常表達。
　　 我們已應(yīng)用含有19378個已知基因的寡核苷酸芯片篩選出正常肝臟、慢性肝炎、肝硬化及HCC差異基因表達譜,分析該基因表達譜發(fā)現(xiàn)周期素依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase5,CDK5)在HCC組織中是一個明顯高表達的基因；早期生長反應(yīng)因子2(the early growth responsive-2,EGR2)在HCC組織中

3、是一個明顯低表達的基因。CDK5是CDK家族中的一員,以前CDK5的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面,其調(diào)節(jié)蛋白p35主要在腦組織表達,p35/CDK5在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)相關(guān)病理改變中起重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)CDK5在前列腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異靜表達,通過改變細胞增殖、凋亡引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EGR2為即刻早期反應(yīng)基因(immediate early genes,IEGS

4、)家族的成員之一,IEGS家族還包括EGR1、EGR3、EGR4,其中EGR1可以參與細胞生長、增值、分化及凋亡等相關(guān)的多種基因的表達。EGR2是一種反式作用蛋白,參與了腫瘤抑制基因PTEN介導(dǎo)的細胞凋亡途徑。在HBV相關(guān)的HCC中,EGR2或EGR3與HBx蛋白結(jié)合,增強FasL啟動子的活性,腫瘤細胞免疫應(yīng)答時活化的腫瘤特異性T細胞Fas表達增加,FasL/Fas途徑介導(dǎo)T細胞凋亡,從而使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。但是CDK5和EGR2在

5、HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制仍然不是十分明確。
　　 本研究通過應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及免疫組織化學(xué)技術(shù)聯(lián)合檢測CDK5和EGR2在人正常肝組織、肝硬化組織、HCC組織中的基因及蛋白異常表達情況,探討CDK5及EGR2在HCC演進過程中的作用,旨在為HCC早期診斷提供理想的候選基因,為潛在的靶向治療途徑提供分子生物學(xué)依據(jù)。材料和方法
　　 正常肝組織17例,肝硬化組織14例,HCC組織39例,均取自河

6、南省人民醫(yī)院肝膽外科2009年3月～2009年6月肝臟手術(shù)切除標(biāo)本。肝硬化和HCC組織乙肝病毒表面抗原(HBsAg)均陽性,正常肝組織HBsAg陰性。疾病診斷均經(jīng)病理證實。標(biāo)本取出后切成小塊狀迅速置于液氮冷凍待用。
　　 按invitrogen公司提供的Trizol試劑盒操作程序分別抽提正常肝組織、肝硬化和HCC組織總RNA,10g/L的瓊脂糖凝膠電泳(180V,30min)檢測總RNA,以評估總RNA的完整性；用分光光度計在2

7、60/280nm測定總RNA吸光度,以計算總RNA的純度；按Promega公司提供的RT-PCR試劑盒操作程序進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。擴增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并用Syngene Gene Genius全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)對CDK5、EGR2擴增產(chǎn)物進行掃描和半定量分析。肝組織常規(guī)行HE染色,進行臨床分期、病理學(xué)分級。使用PV法進行免疫組織化學(xué)檢測,由三個不同的觀察者對結(jié)果進行評判,

8、用顯微掃描成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)拍照、儲存圖片。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0進行Shapiro-Wilk正態(tài)檢驗、成組設(shè)計資料的t檢驗、x2檢驗、fisher’s精確檢驗及Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗的統(tǒng)計學(xué)處理,以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組總RNA提取結(jié)果良好。電泳結(jié)果證實為高純度的RNA,總RNA的吸光度A260/A280值均在1.8～2.0；擴增產(chǎn)物條帶清晰,內(nèi)參基因條帶

9、明亮。
　　 2.CDK5 mRNA在HCC中呈上調(diào)表達,陽性表達率在正常肝組織、肝硬化和HCC組織中分別為35.3％、64.3％、89.7％；正常肝組織與HCC組織有顯著差異(P<0.05),肝硬化組織與HCC組織也有顯著差異(P<0.01)。CDK5蛋白在HCC中高表達,陽性表達率在人正常肝組織、肝硬化和HCC組織之間分別為:29.4％、64.3％、89.7％,三組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=58.095,P<0.01)。H

10、CC組織中CDK5蛋白表達強度與腫瘤的臨床分期顯著相關(guān)(x2=20.901,P<0.01),與病理學(xué)分級顯著相關(guān)(x2=19.330,P<0.01)。EGR2mRNA在HCC中呈下調(diào)表達,陽性表達率在正常肝組織、肝硬化和HCC組織中分別為94.1％、57.1％、15.4％；正常肝組織與HCC組織有顯著差異(P<0.01)。EGR2蛋白在HCC中低表達,陽性表達率在人正常肝組織、肝硬化和HCC組織之間分別為:94.1％、57.1％、15.

11、4％,三組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=40.702,P　　 3.HCC組織分化程度越低CDK5表達程度越高,臨床分期、病理分級程度越高;EGR2表達程度低的HCC組織分化程度也低,而臨床分期、病理分級越

12、高。
　　 結(jié)論：
　　 1.在mRNA及蛋白水平上,CDK5在肝硬化和HCC組織中明顯高表達,說明在促成肝纖維化及HCC的發(fā)生發(fā)展過程中CDK5起著很重要的作用;EGR2在HCC組織中明顯低表達,作為一個腫瘤抑制基因參與的基因修復(fù)途徑異常,與HCC的發(fā)生相關(guān)。
　　 2.CDK5和EGR2表達強度與HCC組織臨床分期和病理特征有關(guān),CDK5的表達程度及EGR2的缺失程度在對HCC組織進行臨床分期和病理分級時可能