1、目的：牙周炎是一種由菌斑細菌引發(fā)的慢性感染性疾病，是人類口腔兩大疾病之一，發(fā)病率較高。大量的研究顯示慢性牙周炎已成為心血管疾病的獨立危險因素，使動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和冠心病等心血管疾病的患病風險大大增加。以往的理論認為AS主要是局部脂質堆積性疾病，近年來，AS發(fā)病機制的炎癥觀點又重新被強調。目前研究認為AS是一個進行性的炎癥反應，局部和遠隔部位感染可以促進AS的慢性炎癥過程。由于AS病因復雜，既包括與脂蛋

2、白代謝有關的基因，也包括環(huán)境因素的影響，且病變發(fā)生較慢，在早期無癥狀，故對其病因和發(fā)病機制的研究進展仍然較慢。而大多數的牙周疾病是可以預防和控制的，有效的牙周治療、積極的控制口腔感染為我們提供了一條減少心血管疾病發(fā)生危險的可能途徑。本研究建立P.gingivalis侵入血管內皮細胞模型，模擬P.gingivalis感染血管壁細胞的體內環(huán)境，觀察P.gingivalis侵入后粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E選擇素表達的變化，探討P.

3、gingivalis在AS疾病發(fā)生中的可能作用，并進一步完成凋控細胞粘附分子表達的信號通路的初探。
　　 材料與方法：
　　 1、選擇P.gingivalis低毒力株ATCC33277和高毒力株W83、人臍靜脈血管內皮細胞株，建立P.gingivalis ATCC33277和W83侵入HUVEC模型。
　　 2、MTT比色法檢測P.gingivalis侵入前后細胞增殖活性變化，流式細胞儀測定細胞周期。
　　

4、 3、Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率，免疫熒光染色和細胞核DNA階梯狀圖譜電泳分析進一步證實細胞凋亡。
　　 4、RT-PCR和Western印跡法檢測P.gingivalis侵入血管內皮細胞前后ICAM-1、VCAM-1和E選擇素基因的mRNA及蛋白表達變化，細胞免疫熒光染色法測定ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白表達。
　　 5、Western印跡法檢測IκB-α和磷酸化p38 MAP

5、K表達；間接免疫熒光法檢測HUVEC NF-κB p65核移位。
　　 6、NF-κB抑制劑MG132和p38 MAPK抑制劑SB203580預處理細胞后，分別建立P.gingivalis ATCC33277和W83侵入模型，分析NF-κB/IκB和p38 MAPK信號通路在P.gingivalis侵入血管內皮細胞影響粘附分子表達過程中的作用。
　　 結果：
　　 1、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內皮細胞增殖和凋亡的

6、影響P.gingivalis侵入后48h，未見細胞增殖受抑制。與對照組比較，P.gingivalisATCC33277侵入后72h，細胞增殖活性降低12.46％；W83侵入后72h，細胞增殖活性降低10.47％，細胞生長增殖活性明顯受抑制(P＜0.05)。P.gingivalis ATCC33277和W83的增殖抑制作用無顯著性差異(P＞0.05)； P.gingivalis侵入改變細胞周期分布，使G1期細胞增加(P＜0.05)，細胞周

7、期在G1期發(fā)生阻滯，P.gingivalis W83使細胞周期發(fā)生改變的時間(24h)早于ATCC33277(48h)；P.gingivalis侵入后24h即誘導凋亡細胞的產生(P＜0.05)。P.gingivalis W83侵入后72h，死亡細胞明顯增加(16.407％)，與ATCC33277侵入組(11.973％)比較有顯著差異(P＜0.05)。熒光顯微鏡觀察證實凋亡細胞的存在；階梯狀電泳圖譜分析顯示P.gingivalis W83

8、作用后24h和48h，HUVEC的核DNA呈現明顯的拖尾條帶，形成典型的DNA ladder。
　　 2、牙齦卟啉單胞菌侵入對血管內皮細胞粘附分子表達的的影響
　　 P.gingivalis ATCC33277和W83侵入后4h即誘導ICAM-1、VCAM-1和E選擇素mRNA表達(P＜0.05)。ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達水平在P.gingivalis侵入后8h達高峰(P＜0.05)，這種高表達可持續(xù)到P

9、.gingivalis侵入后24h(P＜0.05)。E選擇素mRNA表達在P.gingivalis侵入后4h達高峰(P＜0.05)，8h顯著回落(P＜0.05)，至24h時接近基礎表達水平(P＞0.05)；P.gingivalis ATCC33277和W83侵入后4h即誘導ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白表達(P＜0.05)，ICAM-1和VCAM-1蛋白表達在侵入后8h和24h有持續(xù)的高表達(P＜0.05)；E選擇素蛋白表達

10、在侵入后8h達高峰，侵入后24h仍有較高的表達(P＜0.05)；P.gingivalis W83誘導ICAM-1、VCAM-1和E選擇素mRNA和蛋白表達的能力強于ATCC33277(P＜0.05)。細胞免疫熒光染色證實P.gingivalis W83侵入血管內皮細胞后8h誘導ICAM-1、VCAM-1和E選擇素膜蛋白的表達。
　　 3、牙齦卟啉單胞菌感染血管內皮細胞誘導IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB p65核移

11、位
　　 P.gingivalis ATCC33277感染HUVEC后60min導致IκB-α降解，感染后90minIκB-α恢復至基礎水平；P.gingivalis W83感染后30min后即導致IκB-α降解，60min后IκB-α蛋白水平有輕度回升，90min后Iκ3-α恢復至基礎水平；P.gingivalis W83感染使細胞IκB-α降解時間早于ATCC33277。P.gingivalis ATCC33277作用于細胞

12、后30min后導致p38 MAPK磷酸化，60min后p38 MAPK磷酸化水平明顯降低，90min后恢復至基礎水平：P.gingivalis W83感染HUVEC后60min導致p38 MAPK磷酸化，90min后p38 MAPK磷酸化水平明顯降低。P.gingivalis ATCC33277感染HUVEC后60min開始激活NF-κB p65核移位，感染后90min，核移位現象更明顯；W83感染HUVEC后30min即開始有NF-κ

13、B p65核移位，核移位一直持續(xù)到W83感染后90min。
　　 4、NF-κB和p38 MAPK信號通路抑制劑在P.gingivalis感染HUVEC誘導IκB-α降解、p38 MAPK磷酸化、NF-κ3 p65核移位和粘附分子表達過程中的作用
　　 NF-κB抑制劑MG132(20μM)和p38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)預處理細胞30min后，再分別與P.gingivalis ATCC33277和W

14、83(MOI=100∶1)共同培養(yǎng)60min、90min和8h。Western印跡法檢測IκB-α和磷酸化p38 MAPK蛋白表達變化，細胞免疫熒光染色檢測NF-κB p65核移位。結果顯示MG132可抑制P.gingivalis W83感染HUVEC誘導的IκB-α降解、NF-κ3 p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表達，對p38 MAPK磷酸化無影響；SB203580可抑制P.gingiv

15、alis W83感染導致的p38 MAPK磷酸化，對IκB-α降解、NF-κB p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表達無影響。
　　 結論：
　　 1、P.gingivalis侵入血管內皮細胞可抑制其增殖，使細胞周期在G1期細胞發(fā)生阻滯，并誘導細胞凋亡及ICAM-1、VCAM-1、E選擇素mRNA和蛋白高表達的AS樣改變，在AS炎癥病理反應中有重要的意義。有效的牙周治療、積極的

16、控制口腔感染為我們提供了一條減少心血管疾病發(fā)生危險的可能途徑。
　　 2、P.gingivalis ATCC33277和W83侵入血管內皮細胞誘導IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB核移位。NF-κB系統的活化參與了P.gingivalis侵入HUVEC誘導粘附分子表達的過程，NF-κB系統在P.gingivalis感染后的全身炎癥反應中發(fā)揮重要的調控作用，對其進行有效的阻斷和調節(jié)，將可能控制P.gingivalis感