1、一、目的： 通過觀察胃腸道間質(zhì)瘤PDGFRA基因中一個新的突變位點L839P的對中國倉鼠卵巢上皮細胞(CHO)的增殖、凋亡、蛋白表達、裸鼠成瘤性及對伊馬替尼敏感性的影響作用,從而明確PDGFRA基因突變在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的惡性轉(zhuǎn)化作用以及其對腫瘤的伊馬替尼敏感性的影響。 二、方法： 1、收集25例胃腸道、腸系膜及網(wǎng)膜部位的GIST新鮮標本,抽提基因組DNA,PCR擴增后直接送測序檢測PDGFRA基因exon

2、12及exon18突變情況,以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點； 2、將所構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1空載體(NP)、PDGFRA野生型(P)、PDGFRAL839P(M1)、PDGFRA D842V(M2)通過脂質(zhì)體法分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞,用Western-blot法檢測PDGFRA蛋白的表達情況；通過細胞計數(shù)描繪細胞生長曲線,流式細胞儀檢測細胞周期,Annexin V檢測細胞凋亡,從而明確PDGFRA點突變L839P對細胞增殖及凋亡的影響

3、作用： 3、將四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞分別注射于SPF動物裸鼠背部皮下,飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中,以轉(zhuǎn)染空載體組及野生型質(zhì)粒組為對照,觀察轉(zhuǎn)染了PDGFRA突變型質(zhì)粒的CHO細胞的裸鼠成瘤性： 4、將PDGFRA突變型質(zhì)粒(M1、M2)與KIT野生型質(zhì)粒(W)分別共同瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞,Western-blot法檢測KIT的蛋白表達及磷酸化情況,明確共轉(zhuǎn)時PDGFRA突變體對野生型KIT蛋白表達及磷酸化的影響； 5、將PDGFRA四

4、株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞分別與不同濃度伊馬替尼共同孵育72小時后,MTT法檢測細胞增殖活性；將PDGFRA及KIT野生型及突變型質(zhì)粒KIT Ins IPYD579(S)與Del 559-560(Po)分別瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞24小時后,各自加入不同濃度伊馬替尼共同孵育90分鐘后抽提細胞蛋白,Western-blot法檢測蛋白表達及磷酸化情況,從而了解該突變體對GIST的伊馬替尼敏感性的影響作用。 三、結(jié)果： 1、25例GIST中,檢測出

5、一例exonl8點突變Y849H,突變導(dǎo)致第849位酪氨酸被組氨酸所取代:exon12突變未檢測出。 2、四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞抽提蛋白Western-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了PDGFRA野生型(陰性對照組)及突變型(實驗組及陽性對照組)的細胞均有PDGFRA蛋白表達,突變型蛋白表達量有所增加；細胞生長曲線顯示實驗組及陽性對照組較之陰性對照組與空白對照組生長速度加快；細胞周期檢測顯示各組處于增殖期的細胞比例(S+G2-M)依次為：28.38

6、％(空白對照組)、24.47％(陰性對照組)、43.79％(實驗組)、40.89％(陽性對照組);細胞凋亡檢測顯示四組的凋亡率分別為1.77％、1.90％、1.45％、1.57％。 3、陽性對照組及實驗組的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞接種于裸鼠背部皮下,三周后可見腫瘤生長,鏡下顯示為上皮細胞樣的形態(tài)學(xué)特征。 4、PDGFRA突變型質(zhì)粒與KIT野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)CHO細胞后,磷酸化KIT蛋白表達明顯增強。 5、四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞與不同濃度伊馬替

7、尼共同孵育72小時后,加入高濃度伊馬替尼的實驗組較之陽性對照組、空白對照與陰性對照組細胞增殖明顯受抑；PDGFRA野生型(P)及突變型(M1、M2)質(zhì)粒、KIT野生型(W)及突變型(S、Po)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后與不同濃度伊馬替尼共同孵育90分鐘后,M1、S、Po磷酸化蛋白表達明顯受抑,P、M2與W變化不明顯。 四、結(jié)論： 1、本課題檢測出的一例PDGFRA外顯子18的點突變Y849H位于文獻報道的熱點位置,但突變的類型有所不同,

8、突變發(fā)生率為4％。該病例發(fā)生于胃,最大直徑為2.2cm,生物學(xué)行為表現(xiàn)為低度惡性。 2、通過檢測質(zhì)粒NP、P、M1、M2在CHO細胞的表達,從而證實各重組質(zhì)粒已在CHO細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達。 3、與轉(zhuǎn)染空白載體及野生型PDGFRA cDNA組的CHO細胞系相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PDGFRA突變體的細胞生長速度明顯加快,增殖活性更強,處于增殖期的細胞比例明顯較高,凋亡率減少,說明本例GIST中的PDGFRA突變?yōu)楣δ塬@得性突變。

9、 4、含有突變體重組質(zhì)粒的CHO細胞誘導(dǎo)裸鼠腫瘤生成獲得成功,說明本例PDGFRA基因突變對細胞有較強的惡性轉(zhuǎn)化作用,提示PDGFRA基因突變是導(dǎo)致GIST發(fā)生的關(guān)鍵機制之一。 5、PDGFRA基因突變可使野生型KFT蛋白激活,在無配體存在條件下出現(xiàn)自主磷酸化,提示PDGFRA基因突變引起腫瘤發(fā)生的機制除了使PDGFRA蛋白活化外,還可通過激活KIT蛋白引起下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級聯(lián)反應(yīng),從而促進細胞增殖并抑制凋亡,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。