1、目的:獲得重組E2包膜蛋白和NS3重組蛋白,檢測(cè)其抗原性,利用HCV抗原建立HCV抗體檢測(cè)方法,確立最佳反應(yīng)體系,提高 HCV抗體檢測(cè)靈敏度與特異性。
　　方法:用Biosun計(jì)算機(jī)輔助軟件對(duì)HCV E2表位進(jìn)行分析,確定抗原性強(qiáng)的氨基酸序列,針對(duì)該序列設(shè)計(jì)HCV E2引物,從HCV病人抗原陽(yáng)性血清中抽提RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因片段,將其插入pMD-18克隆載體,通過克隆擴(kuò)增后,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,經(jīng)PCR、

2、雙酶切和測(cè)序鑒定;將HCV E2基因連接到pET41a表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET41a-HCV E2,然后轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE與 Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白HCV E2。檢測(cè)其抗原性并將E2和NS3重組抗原建立單片段抗原ELISA檢測(cè),分別從包被緩沖液,聚苯乙烯微孔板,封閉液,樣本稀釋液,標(biāo)本稀釋度,酶滴度,標(biāo)本包被體積等方面,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,然

3、后將E2、NS3輔助抗原及其它抗原作為包被抗原檢測(cè)病人血清中HCV抗體,根據(jù)確定的最佳反應(yīng)體系,進(jìn)行小量臨床樣本檢測(cè),最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:PCR成功擴(kuò)增出HCV E2基因片段(約600bp),測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全相符。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET41a-HCV E2,并在大腸桿菌BL21菌中高效表達(dá)出Mr約為22 kDa的HCV E2重組蛋白,超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化獲得純

4、度在95％以上的HCV E2。純化后獲得E2蛋白濃度為0.4mg/ml,用E2蛋白和NS3做為包被抗原對(duì)本室20份HCV陽(yáng)性、20份HCV陰性質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè),在20份HCV陽(yáng)性標(biāo)本中,NS3檢出12份,檢出率為60%(12/20),E2檢出7份,檢出率為35%(7/20),陰性則全部檢出為陰性。E2、NS3輔助抗原混合后作為包被抗原,對(duì)192份血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA,檢測(cè)結(jié)果與PCR法檢出率相似,兩種檢測(cè)結(jié)果沒有顯著差異。通過對(duì)抗原抗

5、體反應(yīng)體系的優(yōu)化,確定E2和NS3的工作濃度分別為0.025μg/well,0.1μg/well,緩沖鹽包被液為pH值9.6的碳酸鹽緩沖液,酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG)濃度為1:5000,包被體積為100μl,包被方式為NS3先包被較其它方式好。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆HCV E2基因,并構(gòu)建了pET41a-HCV E2原核表達(dá)載體和高效表達(dá)出Mr約22kDa的重組蛋白。
　　2.利用HCV E2和NS3