1、熱應激蛋白(HSPs)是一類存在于所有生物體包括魚類細胞內比較保守的蛋白，在遇到外界刺激時，能誘導或增強其表達，以保護細胞免受損害。即使在正常無應激情況下，許多HSPs也起著維護細胞正常功能的作用。目前主要根據(jù)分子量大小對HSPs進行分類，其中對HSP90、HSP70和低分子量HSPs(16-24kDa)研究較為廣泛。HSP70作為分子伴侶在協(xié)助新生多肽鏈折疊，蛋白質復合體的裝配，以及調節(jié)、修護和降解變性的蛋白質方面起著重要作用。研究證

2、明一些熱應激蛋白可以作為指標測定魚類的應激狀態(tài)。魚體在受到外界環(huán)境因子脅迫時，會生成大量的熱應激蛋白，這些因素包括工業(yè)處理水、重金屬離子、亞砷酸鹽及寄生蟲等環(huán)境因子。 作為一類存在于包括魚類在內的所有生物體細胞比較保守的蛋白，熱應激蛋白在免疫學方面的應用價值也正日益受到人們的關注。研究表明，人類的許多疾病與人體內熱應激蛋白的表達水平有關。由于熱應激蛋白參與了生物的多種免疫應答過程，因此，外界刺激誘導生物機體產生熱應激蛋白，能夠增

3、強生物對某些破壞性因子的抗性。一些病原體內的熱應激蛋白尤其是HSP70家族成員具有很強的免疫原性，是免疫系統(tǒng)的主要靶分子。HSP70在瘧原蟲、錐體蟲、血吸蟲、利什曼原蟲和分支桿菌的感染中起重要的產生免疫原性的作用。真菌中的結節(jié)型組織胞漿菌的一HSP70家族成員是細胞免疫的主要靶子。HSP70是含量最豐富的一大家族HSPs,具有高度保守的序列以及在受到環(huán)境脅迫后能夠大量表達，因此以熱應激蛋白70作為指標來測定魚類的應激狀態(tài)，包括感染或免疫

4、狀態(tài)可能是較為理想的選擇。 本研究的目的是以溶藻弧菌為代表病原菌，以標準水生實驗動物劍尾魚(Xiphophorushelleri)為實驗對象，在病原菌感染或免疫處理后的不同時間點，分別無菌采取肝臟、心臟、頭腎和脾臟組織，從mRNA表達水平上了解劍尾魚HSP70基因的動態(tài)表達水平。在不同時間點，取脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)，檢測劍尾魚淋巴細胞增殖和白細胞介素-2活性。以期找出HSP70基因表達與劍尾魚病原菌感染與免疫狀態(tài)的關系。HSP7

5、0的基因表達采用半定量RT-PCR方法，淋巴細胞增殖和白細胞介素-2活性采用MTT法。結果表明： 1.弧菌中的一種感染性較強的溶藻弧菌能感染劍尾魚，半數(shù)致死量為2.0×108CFU/g。 2.由于目前并無劍尾魚HSP70基因序列的相關報道，本文首次得到了劍尾魚HSP70兩個成員基因的部分序列。采用RT-PCR方法擴增了實驗動物劍尾魚(Xiphophorushelleri)純系RR-B的HSP70家族兩個新成員的cDNA片

6、段，并將其克隆到PMD18-T載體中測序，將測序結果與GeneBank中的核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行同源性比較。利用RT-PCR半定量方法研究了熱應激對兩成員在劍尾魚組織中的表達?？寺～@得了劍尾魚HSP70家族兩成員的cDNA片段，兩序列均包含HSP70家族的特征性簽名序列和熱休克蛋白的定位序列；通過對克隆片段與已發(fā)表的青鳉等魚類HSP70的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列同源性很高，成員一和成員二分別達到

7、85％-89％和82％-99％，氨基酸序列同源性更高，成員一和成員二分別達到97％-99％和93％-99％。一般條件下，兩成員在劍尾魚肝臟、脾臟、頭腎和心臟中不表達，熱應激能刺激成員一在劍尾魚脾臟中表達，成員二在肝臟、脾臟、頭腎和心臟中強烈表達。熱應激能誘導兩成員的表達，并且得到的劍尾魚HSP70兩成員均具有核定位信號序列，推測其可能為誘導表達的HSP70，、而不是組成性表達的HSC70。成員二可能在參與熱應激保護方面起更大作用。

8、 3.許多環(huán)境應激能誘導HSP70在魚類體內的表達，但有關病原菌感染對其表達影響并不清楚。本文利用半定量RT-PCR研究了溶藻弧菌感染對HSP70兩成員在劍尾魚肝胰臟、脾臟、心臟和頭腎組織中的基因表達。活魚樣品在感染前后五個時間點取樣，并與感染致死魚樣品內HSP70兩成員基因表達相比較。結果表明，正常條件下，HSP70兩成員在組織中均不表達。劍尾魚同樣受到溶藻弧菌感染時，不同HSP70表現(xiàn)出不同的基因誘導表達情況，只有在溶藻弧菌感染相

9、當嚴重以至于死亡時，才能誘導HSP70成員一在劍尾魚脾臟中的轉錄表達，HSP70成員二在劍尾魚肝臟、脾臟、頭腎和心臟中均有不同程度的誘導，說明HSP70成員二更有可能參與較強的抗感染過程。溶藻弧菌感染后，在劍尾魚肝胰臟內，直到感染后第8天，HSP70成員二基因才強烈的被誘導表達，HSP70/β-actin比值達到1.80±0.03，感染致死魚肝胰臟內未見表達。頭腎內，除感染第8天誘導HSP70成員二基因強烈表達，第2、5天也有HSP70

10、成員二基因表達，感染致死魚頭腎內也檢測到HSP70成員二基因的強烈表達，HSP70/β-actin比值分別為2.00±0.06，0.35±0.02，0.15±0.01和0.95±0.05。而脾臟內，在溶藻弧菌感染2、5、8天檢測到HSP70成員二基因表達，未在第11天檢測到HSP70成員二表達，感染致死魚脾臟內檢測到HSP70成員二基因的強烈表達。僅感染致死魚心臟中表現(xiàn)HSP70成員二表達，未在活魚心臟內檢測到其表達。與溶藻弧菌感染后第

11、2天開始誘導劍尾魚脾臟HSP70成員二的轉錄表達比較，此時淋巴細胞增殖活性與對照組無顯著差異。在感染后8～17天，淋巴細胞增殖活性極顯著高于對照組(P＜0.01)；白細胞介素-2活性在感染后2～8天極顯著高于對照組(P＜0.01)。由于頭腎和脾臟是魚類重要的免疫器官，HSP70成員二首先在兩器官中被誘導表達，說明HSP70可能較早參與了抗感染免疫。 4.利用半定量RT-PCR研究了溶藻弧菌滅活疫苗接種后對HSP70兩成員在劍尾魚

12、肝胰臟、脾臟、心臟和頭腎組織中的基因表達。結果均未發(fā)現(xiàn)HSP70成員一在劍尾魚的脾臟、肝臟、心臟和頭腎中誘導基因表達。在免疫后第5天脾臟內即開始誘導表達HSP70成員二，這時，脾臟淋巴細胞增殖活性沒有顯著增強，與對照組差異不顯著。頭腎內HSP70成員二誘導轉錄的更早，免疫第2天就能誘導其轉錄。在劍尾魚肝臟和心臟中未發(fā)現(xiàn)HSP70成員二的基因表達。這也強調了劍尾魚脾臟和頭腎在免疫中的重要作用。利用淋巴細胞體外培養(yǎng)技術，采用MTT檢測法對接

13、種溶藻弧菌滅活疫苗劍尾魚的脾臟T淋巴細胞增殖反應進行研究，結果發(fā)現(xiàn)劍尾魚在接種溶藻弧菌滅活疫苗后第8～14天T細胞增殖活性顯著高于對照組(P＜0.01)。通過劍尾魚脾細胞在體外有絲裂素的存在下可以增殖并表達IL-2，并且溶藻弧菌滅活免疫的劍尾魚脾細胞能增強IL-2活性，在接種后第5～14天IL-2活性顯著高于對照組(P＜0.01)。綜合結果表明：溶藻弧菌感染或滅活疫苗免疫在引起IL-2活性增強的同時，誘導HSP70成員二在劍尾魚免疫組織