1、背景和目的：喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤,它占耳鼻喉科惡性腫瘤的11％~22％,病理上約有95％~99％為鱗狀細胞癌。盡管隨著科技的發(fā)展,早期診斷技術(shù)不斷提高,但臨床晚期病例仍占45.2％左右。傳統(tǒng)上以根治性手術(shù)、放療為主,5年生存率為30％~50％。本世紀80年代以來隨著藥物的研究進展,喉癌的治療特別是晚期腫瘤多主張手術(shù)、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用。近幾年來,大量研究證實多西紫杉醇用于頭頸部腫瘤的治療已取得令人鼓舞的初步療效,單

2、獨或聯(lián)合其他抗癌藥物的有效率可達到22％~75％。然而,腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生已經(jīng)成為影響其進一步治療效果的重要因素。目前,腫瘤細胞對化療藥物的耐藥機制尚不明了。近年來的研究認為,凋亡是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的主要模式,而藥物作用后腫瘤細胞發(fā)生的凋亡調(diào)節(jié)的改變可能是藥物耐藥產(chǎn)生的重要因素。細胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor ofapoptosisprotein,IAP)在調(diào)節(jié)腫瘤細胞對凋亡的敏感性方面起著核心作用。survivin是

3、凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protien,IAP)家族中最受重視的一名新成員。survivin的分布不同于家族中其他成員,它只分布在胚胎組織和腫瘤組織,且在不同細胞系中表達量和亞細胞定位不同,也是迄今為止分子量最小、抗凋亡作用最強的IAP。它通過抑制半胱氨酸蛋白酶caspase末端效應(yīng)因子caspase3、7的活性,從而抑制細胞凋亡。近年來survivin基因參與腫瘤的演變、診斷、治療以及抗腫瘤藥物

4、耐藥的機制成為了研究的熱點。
　　本研究選擇了多西紫杉醇體外作用人喉癌細胞系Hep-2細胞,觀察用藥不同時間點及濃度下喉癌細胞內(nèi)survivin mRNA表達的變化,結(jié)合誘導(dǎo)喉癌細胞凋亡的情況,分析survivin基因與藥物誘導(dǎo)的喉癌細胞凋亡之間的關(guān)系,進而探討survivin基因表達的改變與喉癌細胞化療耐藥的關(guān)系。
　　方法：體外培養(yǎng)喉癌細胞系Hep-2細胞,待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。多西紫杉醇由原液稀釋成2000μ

5、g/ml濃度后開始作連續(xù)倍比稀釋,作7個濃度梯度,應(yīng)用MTT比色法檢測不同藥物濃度對Hep-2細胞體外生長的抑制作用,計算出藥物24h、48h對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),并根據(jù)藥物的IC50,選擇2IC50和1/2IC50作為高、低兩個濃度作用于細胞。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測物高濃度處理24h,低濃度處理12、24、48h后存活Hep-2細胞中survivin mRNA的表達水平。利用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況,以凋亡指數(shù)(AI

6、)表示凋亡狀態(tài)。同時應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增survivin基因,顯示不同時間及濃度下survivin基因表達量的改變。統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS13.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料用(?)±s表示,采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD法。判定標準:P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.多西紫杉醇對Hep-2細胞生長的影響隨著多西紫杉醇濃度的升高及作用時間的延長,對Hep-2細胞的生長抑制率也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(

7、P<0.01)。研究得出多西紫杉醇對Hep-2細胞24h的IC50值為7.47ug/ml,95％CI[4.91~10.73];48h的IC50值為4.32ug/ml,95％CI[2.54~6.39]。2.細胞形態(tài)學(xué)的變化倒置顯微鏡下觀察到藥物作用后,細胞貼壁能力、折光性明顯減弱,生長增殖明顯受抑。多西紫杉醇作用4h即可見形態(tài)改變,當(dāng)濃度至80μg/ml作用72h,可見大量細胞漂浮,細胞形態(tài)由多邊形、長梭形,變?yōu)轭悎A形。3.流式細胞術(shù)檢測

8、Hep-2細胞的凋亡低濃度多西紫杉醇(3.7ug/ml)作用細胞24h后出現(xiàn)凋亡峰(亞G1峰),之后的48h組凋亡率明顯增加(p<0.05)。高濃度(15.0μg/ml)作用24h后也出現(xiàn)凋亡峰,且其表達量略高于低濃度藥物作用24h組(p<0.05)。G2/M期阻滯的高峰出現(xiàn)在多西紫杉醇作用Hep-2細胞后的12h,隨后的24、48h G2/M期細胞阻滯的比例逐漸下降。4.多西紫杉醇作用Hep-2細胞中survivin mRNA表達的變

9、化多西紫杉醇高、低濃度作用Hep-2細胞后,存活細胞中survivin mRNA基因的表達均高于陰性對照(P<0.05),但是高、低濃度間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而低濃度連續(xù)作用后,隨著作用時間的延長,存活細胞中survivinmRNA表達量逐漸增加(P<0.05)。藥物處理12、24、48h后的存活細胞內(nèi)的survivinmRNA的表達量分別為陰性對照組的1.40倍、2.76倍、3.68倍。
　　結(jié)論：1.多西紫杉醇