1、背景:
　　 骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組起源于造血干/祖細胞的異質(zhì)性克隆性疾病，其疾病特點為全血細胞減少、病態(tài)造血和高風險向急性髓性白血病轉(zhuǎn)化。骨髓異常增生綜合征的發(fā)病機制目前尚不完全明確，可能與分子遺傳、造血微環(huán)境改變、造血干/祖細胞增殖和凋亡紊亂、免疫缺陷、及抑癌基因甲基化等多種因素有關。目前，骨髓增生異常綜合征患者多為老年患者，因此傳統(tǒng)化療方法和造血干細胞移植并不廣

2、泛適用。
　　 表觀遺傳學是指非基因序列改變導致的基因表達水平的變化，主要是通過DNA甲基化、組蛋白乙酰化等發(fā)揮作用。許多腫瘤細胞抑癌基因的啟動子區(qū)存在高度甲基化，從而使抑癌基因表達降低，這有可能是腫瘤發(fā)生的重要原因。因此去甲基化藥物地西他濱成為近年來骨髓增生異常綜合征研究的熱點。
　　 地西他濱是一種胞嘧啶類似物，能通過抑制體內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT而發(fā)揮作用，從而使甲基化的抑癌基因重新表達而發(fā)揮作用，達到治療腫瘤的目的

3、。起初，地西他濱是作為白血病和實體腫瘤的傳統(tǒng)化療藥物而加以研究。在這些研究中，地西他濱的用藥劑量1500～2500mg/m2，但是引起了嚴重的骨髓抑制，于是這種藥物的高劑量應用的進一步研究被終止。直到1980年，Jones和Taylor發(fā)現(xiàn)低劑量的地西他濱和5-AZA具有逆轉(zhuǎn)DNA甲基化和細胞分化的潛能，才又重新開始了對地西他濱低劑量應用的一系列研究。通過研究已經(jīng)證實，地西他濱應具有雙重作用機制，即高濃度時的細胞毒作用和低濃度是的去甲基

4、化作用。一系列應用低劑量地西他濱治療MDS的臨床試驗，取得了比傳統(tǒng)療法更好的療效，且毒副作用較小，患者可以耐受。但是患者完全緩解率仍然較低，療效具有一定的局限性。
　　 砷為體內(nèi)的一種微量元素，微量的三氧化二砷能夠刺激造血、促進細胞生長和繁殖。三氧化二砷進入人體后，主要在肝臟進行代謝，在5‘-甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，從S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到砷分子上，形成一甲胂酸(MMOL/LA)或二甲胂酸(DMA)被解毒。三氧化二砷也具有雙

5、重作用機制，高濃度時誘導凋亡為主，低濃度是則以誘導分化為主。研究表明，ATO可以通過調(diào)節(jié)Bcl2家族中促凋亡與抗凋亡蛋白的表達，激活其中的促凋亡基因Bax使其表達增加，同時下調(diào)抗凋亡基因Bcl2的表達，此外還可釋放細胞色素C并使線粒體跨膜潛能喪失并促進活性氧化物的生成等途徑促進細胞凋亡。三氧化二砷還可通過抑制谷胱甘肽過氧化氫酶的活性和半胱天冬酶活性，抑制NF-Kβ活性來促進凋亡。由于三氧化二砷在細胞內(nèi)代謝時會消耗甲基的主要原料s-腺苷甲

6、硫氨酸(SAM)，同時消耗甲基化轉(zhuǎn)移酶，而SAM又是細胞內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶所必需的活性因子，因此三氧化二砷在代謝過程既消耗了甲基化所需的原料同時又是甲基化轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量和活性減低，有可能也發(fā)揮著去甲基化作用。Tong等和Fu等將三氧化二砷分別應用于在白血病的U266細胞株和MUTZ-1細胞株中，發(fā)現(xiàn)其可以通過其啟動子的去甲基化而使P15和P16重新表達。Hussein M等將三氧化二砷和同為去甲基化藥物的阿扎胞苷聯(lián)合應用于骨髓瘤的體內(nèi)和體外實

7、驗，結(jié)果表明二者聯(lián)用后的去甲基化作用增加，也提示三氧化二砷與地西他濱的聯(lián)用有可能會產(chǎn)生協(xié)同的作用。
　　 因此，地西他濱與三氧化二砷同時都具有去甲基化的作用。二者去甲基化的機制既有相同的一面，即抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，又有不同的方面，三氧化二砷代謝過程中可以消耗甲基的供體，而地西他濱則不能通過消耗甲基供體而發(fā)揮去甲基化作用。兩種藥物的聯(lián)合應用有可能使細胞的去甲基化作用增強。這為兩者的聯(lián)合應用提供了理論基礎。
　　 地西他

8、濱或三氧化二砷單藥用于惡性血液疾病的治療，患者應用后副作用較傳統(tǒng)化療小，比較適用于老年骨髓增生異常綜合征的治療，但由于其完全緩解率較低，療效有一定的局限性。臨床上，以地西他賓或三氧化二砷為基礎與其他藥物如維生素C、丙戊酸等聯(lián)合應用時，其副作用并無明顯增加。且地西他濱與三氧化二砷的聯(lián)用有可能在腫瘤細胞去甲基化、促進細胞凋亡等方面具有協(xié)同作用，國內(nèi)外尚無地西他濱與三氧化二砷在SKM-1細胞株中的研究報道，因此對于骨髓增生異常綜合征患者治療新

9、方法的探索具有非常積極的意義。
　　 本研究應用細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，應用MTS、流式細胞技術(shù)及實時定量PCR的方法，對地西他濱與三氧化二砷的在SKM-1細胞株的協(xié)同作用進行了初步研究。并應用Calcusyn軟件對細胞增殖情況進行分析，calcusyn軟件是基于中效原理專門用于計算藥物協(xié)同作用的軟件，當計算得CI＜1，說明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用;CI=1，則說明兩藥聯(lián)合是相加作用:CI＞1，說明兩藥聯(lián)合應用具有拮抗作用。
　　

10、 目的:研究地西他濱與三氧化二砷在SKM-1細胞株中聯(lián)合應用的效應，并探討其相關作用機制。
　　 方法:應用MTS方法檢測細胞增殖狀態(tài)，藥物IC50及兩藥聯(lián)合協(xié)同指數(shù)根據(jù)中效原理應用Calcusyn軟件計算;應用流式細胞技術(shù)Annexin v-PE/7-AAD檢測細胞的凋亡率，PI染色法檢測細胞周期;應用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測Bcl2、Bax的基因表達;
　　 結(jié)果:
　　 1.細胞增殖效應檢

11、測:地西他濱和三氧化二砷對SKM-1細胞均有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，地西他濱對SKM-1細胞的IC50為1.42(95％可信區(qū)間:1.08～1.86，r=0.97)μmol/L，三氧化二砷作用于SKM-1細胞的IC50為3.82（95％可信區(qū)間:3.22～4.53，r=0.99）μmol/L。兩藥聯(lián)用協(xié)同指數(shù)CI值介于0.280～0.581(r=0.97)
　　 2.細胞凋亡率及細胞周期檢測:對照組細胞凋亡率為3.43±

12、0.58％，地西他濱2.5、5μmol/L作用后凋亡率分別為4.0±0.69％、4.13±0.99％，與對照組相比無明顯增加(P=0.534);三氧化二砷5、10μmol/L濃度下細胞凋亡率逐漸升高，分別為12.55±0.42％、61.89±12.94％。隨著地西他濱藥物濃度的增加，G2/M期細胞比例明顯增多上(P＜0.001)。2.5μmol/L地西他濱與5μmol/L三氧化二砷聯(lián)合應用細胞凋亡率為22.71±1.41％，能夠使細胞凋

13、亡比率增加(P＜0.001)。
　　 3.細胞BCL2/BAX相對表達量檢測:將從不同濃度藥物作用48小時后的SKM-1細胞中提取RNA，并合成CDNA，進行熒光定量PCR擴增。經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計分析，經(jīng)地西他濱和三氧化二砷單藥作用后，BCL2/BAX比值降低，4和8μmol/L地西他濱濃度下，BCL2/BAX比值降低分別為0.3065±0.0142、0.1686±0.0014，隨地西他濱濃度增多而逐漸降低，(P＜0.001

14、)。1.6、3.2μmol/L三氧化二砷濃度下，BCL2/BAX比值降低分別為0.5615±0.0256、0.2798±0.0166，隨三氧化二砷濃度濃度增多而逐漸降低(P＜0.001)，兩藥聯(lián)合應用較單藥作用下降更明顯，地西他濱4μmol/L+三氧化二砷1.6μmol/L濃度下BCL2/BAX比值為0.2629±0.0050，地西他濱8μmol/L聯(lián)合三氧化二砷3.2μmol/L濃度下BCL2/BAX比值為0.1160±0.0154，

15、兩聯(lián)合用藥組比較及聯(lián)合用藥者與單藥組比較都具有顯著差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.地西他濱和三氧化二砷對SKM-1細胞都具有明顯的抑制作用，且二者聯(lián)合對細胞株具有協(xié)同抑制作用。
　　 2.地西他濱單藥不能使SKM-1細胞凋亡率明顯增加，但能產(chǎn)生明顯的G2/M期細胞阻滯;三氧化二砷能明顯誘導SKM-1凋亡;地西他濱聯(lián)合三氧化二砷能夠協(xié)同誘導SKM-1凋亡3.地西他濱和三氧化二砷均能使SKM-1細胞