1、T細胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細胞提供第一信號外，還需要表達于免疫細胞表面一系列共刺激分子提供第二信號。如果缺少第二信號，將會導(dǎo)致T細胞的無反應(yīng)性或免疫耐受。共刺激分子的協(xié)同加強或負性調(diào)節(jié)在機體免疫應(yīng)答的整個過程中起著及其重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 小鼠B7-H3屬B7超家族新成員。迄今B7-H3的生物學(xué)特性和功能研究尚待深入并存在爭議。目前的研究認(rèn)為，B7-H3在介導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答中存在2種截然不同

2、的作用：協(xié)同刺激或抑制T細胞免疫應(yīng)答。此外一些研究提出B7-H3分子可以作為腫瘤如肺癌，前列腺癌以及神經(jīng)母細胞瘤細胞的表面標(biāo)記分子具有診斷和干預(yù)靶向價值。進而鑒于B7-H3受體尚未得到最終確認(rèn)，這也是B7-H3研究中存在的最大困難。
　　 本研究旨在通過建立小鼠B7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞株，研制特異性單克隆抗體和融合蛋白，從不同角度探討B(tài)7-H3的生物學(xué)功能。
　　 本論文分為兩個部分：
　　 一、小鼠B7-H3基因

3、轉(zhuǎn)染細胞株及其單克隆抗體的研制
　　 1.采用RT-PCR的方法從小鼠骨髓來源的DC中擴增出小鼠B7-H3編碼區(qū)全長基因。經(jīng)雙酶切后插入真核表達載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建成重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3。通過脂質(zhì)體法將測序正確的重組載體pIRES2-EGFP/B7-H3轉(zhuǎn)染293和CHO細胞，G418加壓篩選并經(jīng)過數(shù)次亞克隆。流式細胞術(shù)分析顯示B7-H3基因同時轉(zhuǎn)染的293和CHO細胞膜上能穩(wěn)定高表達小鼠B7

4、-H3分子。為研制小鼠B7-H3單克隆抗體提供了有效的免疫原。2.以轉(zhuǎn)基因細胞株293/B7-H3為免疫原，免疫SD大鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，將免疫大鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞。以CHO/B7-H3為陽性篩選細胞，CHO/mock細胞作陰性對照，F(xiàn)CM分析篩選陽性克隆，經(jīng)過亞克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌大鼠抗小鼠B7-H3單克隆抗體的雜交瘤細胞株（18F9和19F

5、6）。經(jīng)熒光微球法鑒定，兩株單抗重鏈均為IgG2b，輕鏈為κ鏈。Western blot及流式細胞分析均顯示，兩株單抗都能與B7-H3分子特異性結(jié)合，且兩株單抗識別不同的抗原表位。體外長期培養(yǎng)和液氮凍存后，復(fù)蘇的雜交瘤細胞生長狀態(tài)良好，穩(wěn)定分泌抗體。研究發(fā)現(xiàn)小鼠B7-H3在B細胞、單核細胞和DC細胞上組成性表達，在靜息和活化的T細胞、NK細胞上不表達。小鼠B7-H3蛋白表達在膀胱上皮細胞胞漿和膜上，而在其他正常組織幾乎都不表達。由此表明

6、，所研制的單克隆抗體能運用于流式熒光標(biāo)記，免疫印跡及免疫組化，具有重要的應(yīng)用價值。
　　 二、小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表達及其生物學(xué)活性的研究
　　 通過重疊POR技術(shù)將小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重鏈Fc恒定區(qū)基因拼接，按照構(gòu)建B7-H3基因轉(zhuǎn)染細胞的方法將重組基因轉(zhuǎn)染CHO細胞，經(jīng)篩選并獲得CHO/mB7-H3-Fc轉(zhuǎn)染細胞。該轉(zhuǎn)基因細胞無血清培養(yǎng)后，收集細胞上清、超濾濃縮后行Protein G柱純化，

7、獲得純品B7-H3-Fc融合蛋白，經(jīng)Western blot鑒定。通過CCK-8和ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)該融合蛋白對T淋巴細胞的體外增殖和細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌具有明顯的促進作用。在T細胞體外增殖實驗中，單抗的加入可部分阻斷T細胞分泌細胞因子。該融合蛋白識別T細胞上的受體，而與構(gòu)建的TLT2基因轉(zhuǎn)染細胞株不結(jié)合，提示B7-H3的受體可能不是TLT2分子。同時也表明所研制的單抗具有阻斷功能。
　　 綜上所述，本實驗構(gòu)建

8、了基因轉(zhuǎn)染細胞株293/B7-H3和CHO/B7-H3；研制2株特異性大鼠抗小鼠B7-H3功能性單克隆抗體和mB7-H3-Fc融合蛋白基因。該融合蛋白能夠促進T細胞體外增殖及分泌IL-2，IFN-γ。T細胞體外增殖試驗顯示，單抗18F9對B7-H3介導(dǎo)的刺激T細胞分泌細胞因子具有阻斷作用。研究也證實TLT2分子不是小鼠B7-H3的受體。B7-H3作為重要的共刺激分子，在調(diào)節(jié)T細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了正性共刺激作用?？傊鲜鼋Y(jié)果為深入研究B