1、HVEM（Herpesvirus-entry mediator）是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個既能與腫瘤壞死因子超家族成員LIGHT結(jié)合，同時也與免疫球蛋白家族成員BTLA結(jié)合的共刺激分子，被稱為是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答的分子開關(guān)。HVEM是單純皰疹病毒侵入機(jī)體的媒介，是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族中的一員。HVEN既是TNF家族成員LIGHT及LTα的受體，又是單純皰疹病毒gD糖蛋白（HSV1-gD）、LTα3、BTLA和CD160分子的配體。H

2、VEM既能與LIGHT、LTα3結(jié)合產(chǎn)生正性刺激信號促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖，也能通過與BTLA、CD160的結(jié)合產(chǎn)生負(fù)性信號從而抑制T細(xì)胞活化與增殖。因此，HVEM充當(dāng)了一個能同時介導(dǎo)正性和負(fù)性信號的角色。HVEM與TNFR/TNF超家族和CD28/B7超家族成員之間的交叉作用形成的微觀網(wǎng)絡(luò)跨越了共刺激分子家族內(nèi)部的相互作用，將共刺激信號和共抑制信號協(xié)調(diào)地聯(lián)系在了一起，形成了一個對T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著對HVEM功能不斷地深入研

3、究，HVEM在細(xì)胞和體液免疫中參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用越來越重要。將來可能被廣泛應(yīng)用到自身免疫性疾病、移植排斥、心腦血管疾病及惡性腫瘤等多個臨床領(lǐng)域。由此可見，分析和揭示其對免疫應(yīng)答的調(diào)控作用有重要的生物學(xué)意義。
　　 本研究旨在通過克隆人HVEM基因，建立基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株作為免疫原免疫小鼠，研制獲得鼠抗人HVEM單克隆抗體，并以表達(dá)人HVEM分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞和鼠抗人HVEM單抗為手段，研究揭示人HVEM分子的生物學(xué)特性及其對T細(xì)

4、胞增殖作用的效應(yīng)與方式。
　　 一、人HVEM基因的克隆、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)功能的初步研究
　　 目的：通過克隆人HVEM編碼區(qū)全長基因，建立能穩(wěn)定表達(dá)人HVEM分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研制鼠抗人HVEM單克隆抗體提供免疫原；并初步探討基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞在體外對T細(xì)胞活化與增殖的影響。
　　 方法：從此前已插入人HVEM編碼區(qū)全長基因的pMD18-T/HVEM中用PCR法擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)EcoRⅠ和Bam

5、HⅠ雙酶切后插入pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成pIRES2-EGFP/HVEM重組載體，脂質(zhì)體法以重組載體pIRES2-EGFP/HVEM轉(zhuǎn)染鼠L929細(xì)胞。經(jīng)G418長期加壓篩選獲得基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析HVEM分子在基因轉(zhuǎn)染的L929細(xì)胞膜上的表達(dá)；通過MTT法和酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定獲得的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/HVEM體外對T淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 結(jié)果：測

6、序結(jié)果表明，獲得了HVEM編碼區(qū)全長基因，針對HVEM全長基因構(gòu)建的重組載體經(jīng)雙酶切后，能夠釋放出852bp左右的目的基因片段，DNA測序進(jìn)一步證明插入載體中的基因片段與HVEM序列完全一致；流式細(xì)胞術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/HVEM細(xì)胞膜上能穩(wěn)定高表達(dá)人HVEM分子。L929/HVEM和T細(xì)胞體體外細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)表明，與未轉(zhuǎn)染HVEM基因的L929/mock細(xì)胞相比，L929/HVEM能顯著地促進(jìn)抗人CD3單抗（mAb）刺激的T細(xì)

7、胞增殖，以及促進(jìn)T細(xì)胞對IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α的分泌。
　　 結(jié)論：成功建立了可穩(wěn)定高表達(dá)人HVEM基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為研制抗人HVEM隆抗體提供了有效的免疫原?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞L929/HVEM在體外能一定程度地促進(jìn)抗人CD3單抗刺激的T細(xì)胞活化與增殖，并影響細(xì)胞因子的分泌。
　　 二、鼠抗人HVEM單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性鑒定
　　 目的：研制鼠抗人HVEM單克隆抗體為探討人HVEM的分子特

8、性及其介導(dǎo)的正性號對人T淋巴細(xì)胞促進(jìn)作用的效應(yīng)與方式提供必備的物質(zhì)手段。
　　 方法：以高表達(dá)人HVEM基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/HVEM為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，并以基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/HVEM和L929/mock流式篩選分別陽性、陰性雜交瘤克隆，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得一株特異分泌鼠抗人HVE

9、M分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結(jié)合抑制以及Westernblot等試驗(yàn)，對獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；用間接免疫熒光法初步分析單抗對不同來源人腫瘤細(xì)胞株的識別作用。
　　 結(jié)果：成功獲得一株穩(wěn)定特異分泌鼠抗人HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2811。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上，液氮凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞的生長狀態(tài)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。染色體數(shù)目分析顯示

10、，雜交瘤細(xì)胞株的染色體在100條以上。雜交瘤細(xì)胞核型分析顯示，雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過小鼠B細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)，表明為融合體；經(jīng)過快速定性試紙分析顯示，單抗輕鏈均為K鏈，重鏈為IgG1亞類；Western blot分析結(jié)果顯示單抗2811與HVEM-Fc融合蛋白特異性結(jié)合，形成陽性條帶；采用本室建立的腹水誘生法制備單抗，腹水形成陽性率約為80％以上，腹水的收獲量平均為3.5ml/只。經(jīng)（NH4）2SO4鹽

11、析法純化單克隆抗體，腹水中抗體蛋白的得率為0.5mg/ml。純化抗體用于間接免疫熒光檢測的用量為0.5～1.0μg/1×106細(xì)胞。單抗2811與不同來源的人腫瘤細(xì)胞株作用結(jié)果表明在測定的腫瘤細(xì)胞株中，單抗檢測到白血病來源的細(xì)胞株THP-1表達(dá)人HVEM分子。
　　 結(jié)論：成功獲得1株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人HVEM單抗的雜交瘤細(xì)胞株，單抗的研制成功也為揭示HVEM的膜表達(dá)特性、深入探討B(tài)TLA/LIGHT/HVEM共信號對T細(xì)胞的

12、調(diào)節(jié)作用及其發(fā)揮作用的信號機(jī)制提供了必備的物質(zhì)手段。
　　 總之，本論文主要開展了如下工作：克隆獲得人HVEM編碼區(qū)正確的全長基因，建立了基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/HVEM，初步探討了L929/HVEM對T細(xì)胞增殖與活化的促進(jìn)作用；以L929/HVEM為免疫原免疫小鼠研制獲得一株特異性分泌鼠抗人HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2811；T細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)表明，單抗2B11對L929/HVEM介導(dǎo)的促T細(xì)胞增殖與細(xì)胞因子分泌具有一定