1、馬鈴薯是國際上第四大糧食作物。由致病疫霉菌引起的晚疫病是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最具破壞性的植物病害之一，在世界各地廣為流行，晚疫病防治一直為國際社會所關(guān)注。由于水平抗性是由微效多基因控制的非小種?；剐裕剐暂^為持久、穩(wěn)定，所以選育廣譜、持久的水平抗性品種已成為馬鈴薯晚疫病抗性育種的必然趨勢。目前，研究人員已開展了水平抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(QTL)的定位以及差異表達基因分離、鑒定等工作，但這些基因在晚疫病菌侵染期間的動力學表達模式、參與的防衛(wèi)

2、代謝途徑和調(diào)控機制以及水平抗性信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。為此，本研究應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)，綜合分析了1009條馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)的表達序列標簽(ESTs)在晚疫病菌和不同非生物因子處理下的動態(tài)表達模式，并比較了這些ESTs在不同抗性馬鈴薯品種(系)中的表達差異，旨在揭示晚疫病水平抗性的分子基礎(chǔ)，為有效利用水平抗性提供理論依據(jù)與技術(shù)策略。主要研究結(jié)果如下： (1)以水平抗性馬鈴薯品系葉片為材料，全面分析了1009條ESTs在晚

3、疫病菌侵染過程中的動態(tài)表達模式。以每個樣點在接種與對照樣品中的雜交信號比值>2.2為標準，篩選出669個顯著差異表達ESTs，經(jīng)測序、比對、合并重復(fù)類型后，共得到348個代表不同基因的非重復(fù)序列片段，其中234個與已知功能基因(或ESTs)具有顯著序列相似性，而其它114個則被暫定為未知功能ESTs(約占32.8％)。234個已知功能ESTs分屬于13個功能類別，即細胞防御、初級代謝、次級代謝、能量代謝、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白．質(zhì)合成

4、、蛋白質(zhì)降解、細胞運輸、細胞結(jié)構(gòu)、結(jié)合功能蛋白、系統(tǒng)性反應(yīng)和發(fā)育。根據(jù)鑒定基因的病原誘導(dǎo)表達模式，可將馬鈴薯對晚疫病菌的防衛(wèi)過程大致區(qū)分為三個明顯時期，從而在分子水平上初步揭示了晚疫病菌侵染馬鈴薯葉片的自然過程，并預(yù)測了這些事件發(fā)生的時間順序以及參與每個階段的基因。這些基因的病原誘導(dǎo)表達譜可作為馬鈴薯防御機制深入研究的重要平臺，并可為確定晚疫病水平抗性候選基因及其參與的防御路徑、調(diào)控機制等研究提供線索。 (2)在上述348個晚疫

5、病抗性相關(guān)基因中，包括98個代謝相關(guān)基因。根據(jù)這些基因在晚疫病菌侵染后的動態(tài)表達模式，初步推斷，共有11條代謝途徑可被晚疫病菌誘導(dǎo)激活，即莽草酸途徑、苯丙烷類途徑、氧合脂類途徑、多胺合成與降解途徑、生物堿合成途徑、乙烯(ET)合成途徑、糖酵解途徑、類異戊二烯途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)途徑。這些代謝相關(guān)基因各自具有的特異性誘導(dǎo)表達模式暗示了上述途徑可能在相互聯(lián)系、彼此協(xié)調(diào)的代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，從而共同參與了馬鈴薯抵御晚疫病

6、菌侵染過程。位于上游的糖酵解和莽草酸途徑對于滿足下游的三羧酸循環(huán)、類異戊二烯、生物堿合成和苯丙烷類等代謝途徑所需的底物供應(yīng)是非常必要的。此外，分別產(chǎn)生水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和ET的苯丙烷類途徑、氧合脂類途徑和ET合成途徑的激活表明三大防衛(wèi)／脅迫信號分子可能介導(dǎo)了馬鈴薯對晚疫病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。 (3)經(jīng)外源SA、茉莉酸甲酯(MJ)和乙烯利(ETH)處理QR葉片后，根據(jù)上述348個基因在不同處理下的動態(tài)表達模式可以判斷，絕大部

7、分晚疫病菌應(yīng)答基因也能被三種信號分子的一種或多種調(diào)控，意味著依賴于SA的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)途徑和依賴于JA/ET的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)途徑在馬鈴薯晚疫病水平抗性材料中同時存在，并共同參與了馬鈴薯對晚疫病菌的抗性反應(yīng)。根據(jù)WRKY、ERF、MYC等轉(zhuǎn)錄因子基因在SA、MJ和ETH處理下的不同誘導(dǎo)表達譜，初步推測，三大信號途徑可能在各自信號傳導(dǎo)的下游實現(xiàn)整合，最終介導(dǎo)了馬鈴薯抵御晚疫病菌侵染的協(xié)調(diào)統(tǒng)一的防衛(wèi)反應(yīng)。 (4)以QR

8、葉片為實驗材料，全面分析了上述348個基因在機械傷害和脫落酸(ABA)處理下的動態(tài)表達變化。結(jié)果表明，這些基因中的絕大部分也能被機械傷害誘導(dǎo)表達，說明植物防衛(wèi)反應(yīng)與傷害反應(yīng)之間存在廣泛的交叉互作。ABA處理也能誘導(dǎo)大量晚疫病菌應(yīng)答基因的上調(diào)表達，但在個別處理時間點上卻又抑制了某些基因轉(zhuǎn)錄，初步揭示ABA在植物抗病防御反應(yīng)中可能具有雙重調(diào)節(jié)作用。此外，在所鑒定的348個基因中，絕大部分可被晚疫病菌、機械傷害和ABA共同誘導(dǎo)表達，反映了植物

9、防衛(wèi)反應(yīng)與脅迫反應(yīng)的協(xié)調(diào)統(tǒng)一性。 (5)以QR、垂直抗性品種(E3)和感病品種(卷心烏)葉片為材料，比較了上述348個基因在三種材料中的晚疫病菌誘導(dǎo)表達模式。結(jié)果表明，來源于QR的絕大部分抗性相關(guān)基因也能在E3和卷心烏中被晚疫病菌誘導(dǎo)表達，但許多基因的誘導(dǎo)表達模式及表達量卻存在明顯差異。初步推測，在不同抗性馬鈴薯品種(系)防御晚疫病菌侵染過程中，彼此之間參與防衛(wèi)反應(yīng)的基因種類和數(shù)量可能并無大的差別，其抗性水平的差異可能取決于病原

10、侵染引起的某些“特異誘導(dǎo)基因”的特異表達或某些抗性相關(guān)基因啟動表達早晚及誘導(dǎo)表達強弱：許多基因在垂直抗性品種中表達較早、表達量較高，而在感病品種中的表達量則明顯偏低，表達時間相對滯后；在水平抗性材料中的表達模式較為多變，有時與垂直抗性品種相似，有時卻與感病品種趨同，這或許反映了水平抗性機制的復(fù)雜性。 (6)根據(jù)348個馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因在晚疫病菌侵染和SA、MJ、ETH處理后的動態(tài)表達變化以及98個代謝相關(guān)基因所

11、參與的代謝途徑，初步推測了馬鈴薯晚疫病水平抗性機制。當馬鈴薯識別晚疫病菌侵染的信息后便會啟動多重防御體系，主要體現(xiàn)在：細胞壁加固以阻止病原物入侵；對病原物起拮抗作用的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累，以抑制、殺死入侵的病原菌，其中涉及到的次生代謝途徑主要有苯丙烷類途徑和氧合脂類途徑等；某些非生物脅迫反應(yīng)機制和細胞保護機制也可能參與了馬鈴薯對晚疫病菌的防衛(wèi)反應(yīng)；局部和系統(tǒng)性防御體系的誘導(dǎo)，前者主要是指過敏性反應(yīng)(HR)，而后者主要是指SAR和IS