1、目的: 本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)特定引物，從含人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human hepatocyte growth factor hHGF)的人肝臟組織總RNA中，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出hHGF cDNA，構(gòu)建重組pcDNA3.1+-hHGF真核表達(dá)質(zhì)粒，繼而轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，并為下一步研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.設(shè)計(jì)兩端合適酶切位點(diǎn)的引物，利用高保真、長(zhǎng)片

2、段PCR技術(shù)擴(kuò)增制備HGF cDNA，利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的片段。 2.利用TA克隆技術(shù)，將hHGF cDNA與T載體pGEM-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pGEM-T-hHGF。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序。 3.將測(cè)序正確的pGEM-T-hHGF用NheI和BamH I依次酶切，將所得hHGF cDNA片段與同樣酶切亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化E

3、.coli DH5α，構(gòu)建pcDNA3.1+-hHGF重組質(zhì)粒。隨機(jī)挑選白色菌落，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序。并中量制備質(zhì)粒。 4.將重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hHGF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在293T細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果: 1.將以人肝組織總RNA為模板擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.6％瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物主要為單一、清晰條帶，大小約為2.2kb。 2.對(duì)pGEM-T

4、-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF分別進(jìn)行酶切鑒定及DNA序列分析。酶切鑒定表明HGF cDNA為2211bp的DNA片段。兩個(gè)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果相同，且與Genbank中人類(Homo Sapiens)HGF基因序列一致，證實(shí)pGEM-T-hHGF和pcDNA3.1+-hHGF重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.將重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hHGF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用ELISA方法于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72小時(shí)檢測(cè)到肝細(xì)胞生長(zhǎng)