1、組織工程是一門正在迅速發(fā)展的學(xué)科，它的目標(biāo)是結(jié)合細(xì)胞、生物材料和生物活性分子來制造、修復(fù)甚至替代組織和器官。心肌組織工程是組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。近年來，心肌組織工程研究發(fā)展迅速，要保證工程化心肌組織在體內(nèi)移植后存活并發(fā)揮功能，及時(shí)充分的血液供應(yīng)起著重要作用。在組織工程化心肌血管化研究方面常使用的方法有：細(xì)胞支架材料復(fù)合體中添加促血管生長因子、心肌細(xì)胞支架材料復(fù)合體中添加內(nèi)皮細(xì)胞、將復(fù)合體移植到體內(nèi)血運(yùn)豐富的部位來促進(jìn)其血管化等。血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞是形成血管網(wǎng)絡(luò)的主要功能細(xì)胞，到目前為止，通過在心肌細(xì)胞和支架復(fù)合體中復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞的方式促進(jìn)再造心肌的血管化是目前研究的熱點(diǎn)。 本研究首先嘗試分離培養(yǎng)人臍靜脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞，并與細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混合制備組織工程化內(nèi)皮片層，探索內(nèi)皮細(xì)胞能否在細(xì)胞外基質(zhì)凝膠中存活，并形成一定結(jié)構(gòu)；然后以細(xì)胞外基質(zhì)凝膠為支架，以新生大鼠心室肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建適用于臨床修復(fù)治療用的組織工程化心肌片層；最后以新生大鼠心室肌細(xì)胞與人臍靜

3、脈內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，以細(xì)胞外基質(zhì)凝膠為支架材料，并施以靜態(tài)拉伸，混合構(gòu)建組織工程化血管化心肌片層。觀察內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間相互作用的關(guān)系，并進(jìn)行初步的組織學(xué)鑒定與超微結(jié)構(gòu)觀察，對組織工程化心肌片層的血管化進(jìn)行初步探索性研究。本實(shí)驗(yàn)嘗試以細(xì)胞外基質(zhì)凝膠為支架加入人臍帶來源的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程化心肌片層，并施以靜態(tài)拉伸力，不但可以使構(gòu)建的組織工程化心肌片層更為穩(wěn)定，同時(shí)也可以使再造的組織體外維持一定的張力，增強(qiáng)了再造組織的致密性和質(zhì)量

4、，以期使組織工程化心肌能夠在移植后快速的血管化，提高細(xì)胞存活率，更好的應(yīng)用于臨床，相關(guān)研究未見報(bào)道。 通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)模型中，人臍靜脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞在支架中生長狀態(tài)良好，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，支架材料內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸聚集并形成條索樣的血管組織，采用新生大鼠心室肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)凝膠復(fù)合方式可以在體外再造出片層狀心肌組織，構(gòu)建的組織工程化心肌片層具有心肌組織類似的結(jié)構(gòu)和特性。在三維共培養(yǎng)模型中，可觀察到心肌細(xì)

5、胞在支架內(nèi)活力良好(包括跳動(dòng)強(qiáng)度，活細(xì)胞數(shù)量、死細(xì)胞數(shù)量、心肌形成質(zhì)量、收縮頻率、細(xì)胞凋亡率)，通過細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡少，明顯優(yōu)于單純心肌細(xì)胞組(P<0.05，t檢驗(yàn))。隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，支架材料內(nèi)的心肌細(xì)胞逐漸聚集并發(fā)育成心肌組織，心肌組織質(zhì)量優(yōu)于單純心肌培養(yǎng)組。電鏡觀察可見明顯的橫紋結(jié)構(gòu)，以及心肌組織的特征性的超微結(jié)構(gòu)，如T小管，閏盤等。與單純心肌細(xì)胞組相比，在形成的心肌組織中，隨著時(shí)間的延長，可見更為明顯的條

6、索樣微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，至21天檢測發(fā)現(xiàn)微血管網(wǎng)絡(luò)范匿、密度加大，并可見口徑較大的管腔結(jié)構(gòu)樣的小血管形成。 本研究是在液態(tài)膠原中對心肌組織工程血管化研究的首次嘗試。具體研究內(nèi)容如下： 第一部分：分離培養(yǎng)人臍靜脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞，并與細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混合制備組織工程化內(nèi)皮片層。 第二部分：以新生大鼠心室肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，與細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混合構(gòu)建工程化心肌組織片層。 第三部分：以新生大鼠心室肌細(xì)胞與入臍靜脈內(nèi)皮