1、研究目的:
　　蟾蜍自古就被作為攻毒類中藥在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。而自中華大蟾蜍陰干的蟾皮中提取的華蟾素注射液在臨床被廣泛應用于抗腫瘤治療，并得到臨床驗證。對華蟾素作用機制的研究頗多，基本局限在mRNA及蛋白水平，尚不能作為靶標指導臨床何時使用華蟾素有效。而miRNA是調(diào)控mRNA及其所表達蛋白的上游基因，許多研究推測miRNA可作為腫瘤治療的靶點，故本研究旨在探討miRNA參與華蟾素抑制胃癌細胞增殖促凋亡的機制，從而找出華蟾素

2、作用靶點，以期指導臨床個體化用藥。
　　研究方法:
　　應用MTT法及流式細胞術等，檢測華蟾素抑制人胃癌BGC-823細胞增殖的抑制率及促凋亡率率，證實華蟾素的有效作用后，采用基因芯片技術分析得華蟾素作用于BGC-823細胞48小時后miRNAs表達的變化譜，并獲得一些候選的miRNAs分子，再對這些分子用實時定量PCR法檢測其表達變化與對照組（生理鹽水）的差別，而獲得最顯著差異表達的miRNA分子(miR-494)。

3、>　　將miR-494 mimics轉染到BGC-823細胞，并用實時定量PCR法檢測轉染miR-494mimics后BGC-823細胞中miR-494表達量的變化以驗證轉染效果。再用細胞增殖試驗（CCK法）及流式細胞術分析轉染miR-494 mimic滿意的BGC-823細胞較對照組增殖及凋亡情況;生物信息學軟件TargetScan，PicTar，and Miranda預測miR-494下游靶基因(BAG-1);Western-blo

4、t法檢測轉染miR-494 mimic后BGC-823細胞中BAG-1表達情況。用miR-494 mimics轉染293T（人T抗原腎上皮細胞）細胞后與BAG-1培養(yǎng)，雙熒光素酶試驗檢測轉染miR-494 mimic后，BAG-1的表達與轉染miR-494 mimic的關系，從而證實miR-494與BAG-1之間有否靶向關系。
　　實驗結果:
　　1)隨著藥物質量濃度的增加，華蟾素對人胃癌BGC-823細胞的生長抑制作用明顯

5、增強，具有劑量、時間相關性。提示50mg/ml濃度72小時組對癌細胞抑制率最高46.35％，與其他濃度組及紫杉醇陽性對照組比較統(tǒng)計學有顯著意義(P＜0.05)。流式細胞術檢測華蟾素對BGC-823細胞作用48小時后細胞凋亡的影響，結果50mg/ml濃度組凋亡率為34.5±1.3，與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。說明華蟾素可以抑制BGC-823細胞的增殖，促進其凋亡。
　　2)華蟾素處理人胃癌細胞BGC-823細胞系4

6、8h后，與生理鹽水對照組相比，共得到527個miRNAs表達變化的miRNAs表達譜，其中33個miRNA表達上調(diào)1.5倍以上，12個miRNA表達下調(diào)1.5倍以下。篩選后實時定量PCR驗證12個miRNA分子(hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-493、hs

7、a-miR-301a-3p、hsa-miR-494、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-454-3p)得到:miR-494是與華蟾素最顯著上調(diào)的miRNA分子。
　　3)將miR-494 mimics轉染到BGC-823細胞后培養(yǎng)，用實時定量PCR法檢測轉染miR-494 mimics后BGC-823細胞中miR-494表達量的變化，結果隨時間達72小時miR-494呈過表達狀態(tài)，說明轉染效果好。被轉染miR-494 m

8、imics的BGC-823細胞系培養(yǎng)，細胞增殖試驗（CCK法）及流式細胞術分析與對照組相比可以顯著抑制BGC-823細胞的增殖，并促進細胞的凋亡。
　　4)生物信息學方法預測BAG-1是miR-494下游靶基因，其3'UTR區(qū)存在miR-494結合區(qū)域。
　　5)Western-blot法檢測BAG-1，與對照組及轉染NC mimic后的BGC-823細胞中BAG-1表達量相比，轉染miR494后BCG-823細胞中BAG-

9、1表達量顯著下降（*p＜0.05）。雙熒光素酶試驗檢測轉染miR-494 mimic后的293T細胞與BAG-1培養(yǎng)，結果顯示轉染miR-494mimic后BAG-1顯著下調(diào)，即miR-494上調(diào)時BAG-1下調(diào)。
　　結論:
　　華蟾素抑制人胃癌BGC-823細胞增殖過程中伴隨miRNAs表達譜的變化，華蟾素可能是通過誘導miR-494作用于BAG-1蛋白而參與抑制胃癌細胞增殖、促進細胞凋亡作用的。所以，我們推測miR-4