1、目的：觀察TGF-B<,2>(Transforming Growth Factor-B<,2>)是否能誘導體外培養(yǎng)的小鼠視網(wǎng)膜干細胞(Retina Stem Cell，RSC)的分化；并以胎牛血清為對照，觀察其對視網(wǎng)膜干細胞誘導分化作用的強弱。 方法 1、RSC的分離培養(yǎng)及鑒定孕齡17 d(天) 的昆明小鼠處死，取出胚胎，迅速剖出胎鼠的眼球，在手術(shù)顯微鏡下分離視網(wǎng)膜干細胞并進行培養(yǎng)，傳代，完成第六代傳代后，進行視網(wǎng)膜干細

2、胞的Nestin和CHX-10免疫熒光鑒定。 2、RSC的誘導分化及鑒定將第六代細胞離心，沖洗，重新接種于培養(yǎng)瓶，然后進行誘導分化，分為10％胎牛血清誘導分化組，TGF-B<,2>(10ngPml)誘導分化組，和空白對照組。并進行抗GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)、抗Opsin、抗B-tubulinⅢ、抗PKC(Protein Kinase c)免疫熒光染色，鑒定終末細胞。 3、

3、熒光顯微鏡下觀察結(jié)果在熒光顯微鏡下隨機數(shù)10個非重疊視野(×20)，計算抗GFAP、抗Opsin、抗B-tubulinⅢ、抗PKC陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，即：陽性細胞率。采用統(tǒng)計學分析方法，比較不同條件誘導分化的終末細胞的陽性率是否具有統(tǒng)計學差別。觀察不同的誘導條件對視網(wǎng)膜干細胞誘導分化作用的強弱。 結(jié)果 1、體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜干細胞團的形態(tài)觀察及熒光鑒定分離的視網(wǎng)膜干細胞進行培養(yǎng)可形成懸浮生長的細胞團，經(jīng)多次傳代，細胞

4、增殖能力未見衰減。到第6代，培養(yǎng)的細胞生長狀況良好，細胞折光性強，細胞團邊緣的細胞界限比較清楚。分別對細胞團的Nestin和Chx-10抗原進行熒光染色，Nestin和Chx-10染色陽性表明所培養(yǎng)細胞為胚胎發(fā)育早期視網(wǎng)膜內(nèi)原始細胞。 2、三組分化細胞的熒光檢測培養(yǎng)細胞經(jīng)10％胎牛血清和TGF-B<,2>(10ngPml)誘導可向成熟細胞分化，免疫熒光檢測顯示分化細胞可分別表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞、感光細胞、雙極細胞以及節(jié)細胞的特異性抗

5、原GFAP、Opsin、PKC及B-tubulinⅢ。在未加胎牛血清和TGF-B<,2>的空白對照組僅見極少量的分化細胞。 3、熒光顯微鏡下觀察結(jié)果及統(tǒng)計學分析結(jié)果DMEM/F12+10％胎牛血清組和DMEM/F12+TGF-B<,2>(10ngPml)組誘導分化后的抗B-tubulinⅢ、抗Opsin、抗GFAP、抗PKC陽性細胞率分別進行比較，行統(tǒng)計學分析，P值均<0.05，具有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論 1、TGF