1、乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的乙型肝炎是嚴重威脅人類健康的重大傳染性疾病，目前全世界HBV持續(xù)感染者超過3.5億，我國約有1.2億感染者。約有25％的HBV持續(xù)感染者會發(fā)生肝纖維化，并有可能發(fā)展為肝硬化或肝細胞癌。乙型肝炎沒有理想的治療方案，疫苗仍是目前控制HBV感染的有效手段。乙肝表面抗原(surfaceantigenofHBV,HBsAg)刺激產(chǎn)生的表面抗體(surfaceantibodyofHBV,H

2、BsAb)具有中和活性，可以預防HBV感染，20世紀80年代以來，真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)的這種HBsAg疫苗在臨床廣泛應(yīng)用，但是接種人群中有5％～10％的個體免疫系統(tǒng)無應(yīng)答或低應(yīng)答，還有部分HBV變異株仍可感染接種者，因此HBV的新型疫苗研究是十分必要的。 細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)所介導的細胞殺傷作用在病毒感染的免疫應(yīng)答和痊愈過程中起核心作用。HBV的核心基因(coregene，C基因)

3、在不同亞型間最為保守，而且其編碼蛋白中CTL表位和構(gòu)象型B細胞表位廣泛存在，是比較理想的疫苗研究靶分子；保守的前S1基因(preS1gene，preS1基因)編碼蛋白含有HBV和肝細胞膜結(jié)合的位點，針對該片段的前S1抗體是除HBsAb之外的又一中和抗體。 分枝桿菌可有效表達同源或異源基因相關(guān)的抗原分子，以活菌免疫方式持續(xù)誘導機體產(chǎn)生特異的保護性免疫應(yīng)答。卡介苗(BacillusCalmetteGuerin，BCG)先用于該類疫苗

4、研究來防治結(jié)核，但它生長緩慢和轉(zhuǎn)化效率低，恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis，M.S)生長迅速，培養(yǎng)容易，轉(zhuǎn)化效率相對較高，近年來在多種病原微生物疫苗研究中得到了應(yīng)用。 本研究根據(jù)CTL表位和B細胞表位識別特征，以HBV截短C基因融合preS1基因為基礎(chǔ)，構(gòu)建了原核表達載體、真核表達載體和重組恥垢分枝桿菌，比較了重組恥垢分枝桿菌、基因免疫誘發(fā)體內(nèi)細胞免疫應(yīng)答和體液應(yīng)答水平，探索了恥垢分枝桿菌運載HBV相關(guān)

5、抗原的可行性，為進一步研究HBV新型疫苗奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容包括： 1.HBV截短C基因融合preS1基因在大腸桿菌中的表達、純化和鑒定以雙酶切方式從真核表達載體pcDNA3.1(-)-C-preS1上獲得融合基因，再將它插入到經(jīng)相同雙酶切后的原核表達載體pET28a，構(gòu)建了融合基因的原核表達質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后經(jīng)IPTG誘導可高效表達目的基因，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物可見24kD的新生蛋白條帶，與預期相對

6、分子量相符。該表達蛋白以包涵體形式存在，親和層析法獲得了純化的該蛋白，蛋白印跡(Westernblot)和酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)顯示該純化蛋白可特異性結(jié)合抗體。 2.HBV截短C基因融合preSl基因穩(wěn)定表達細胞系的建立設(shè)計特異引物，從含有HBV全基因組的質(zhì)粒pCPl0中擴增截短C基因和preSl基因，再將它們分別克隆到pcDNA3.1(-)真核質(zhì)粒，構(gòu)建了

7、真核表達載體pcDNA3.1(-)-C-preS1，酶切鑒定和測序分析確認插入序列正確后，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染P815細胞，通過G418篩選得到了陽性細胞克隆。該細胞克隆經(jīng)RT-PCR可檢測到融合基因條帶，間接免疫熒光法可觀察到P815轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的綠色熒光蛋白，能穩(wěn)定表達融合基因的P815細胞系的建立為基因免疫(DNA免疫)和CTL殺傷分析奠定了基礎(chǔ)。3.HBV截短C基因融合preS1基因在恥垢分枝桿菌中的表達及小鼠體內(nèi)免疫學特性研究

8、 設(shè)計特異引物，從含有HBV全基因組的質(zhì)粒pPCP10中擴增截短C基因和preS1基因，再分別將它們克隆到分泌表達型穿梭載體pDE22，構(gòu)建了穿梭表達質(zhì)粒pDE22-C-preS1，酶切鑒定和測序分析確認插入序列正確后，將重組質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌內(nèi)，經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR方法鑒定出1株含融合基因的重組恥垢分枝桿菌。42℃熱誘導重組恥垢分枝桿菌，SDS-PAGE和Westernblot分析顯示截短C基因融合preS1基因在恥垢

9、分枝桿菌中可分泌表達。 以BALB/c小鼠為對象進行免疫注射。免疫物分別為生理鹽水、pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒、重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-C-preS1、恥垢分枝桿菌和重組恥垢分枝桿菌。各組均免疫2次，每次間隔3周。前期重組恥垢分枝桿菌免疫組抗體滴度升高幅度低于基因免疫組(p＜0.05)，后者45天達到到峰值1∶5100，45天后重組恥垢分枝桿菌免疫組抗體滴度高于基因免疫組(p＜0.05)，前者抗體滴度第60天達到峰

10、值1∶6900，且維持時間較基因免疫組更長(p＜0.05)；基因免疫組和重組恥垢分枝桿菌免疫組誘導的免疫小鼠脾淋巴細胞增殖有顯著差異，前者的刺激指數(shù)低于后者(p＜0.05)；重組恥垢分枝桿菌誘導的特異性CTL殺傷率最高為50.2％，基因免疫組誘導的特異性CTL殺傷率最高為31.6％，二者有顯著差異(p＜0.05)。 4.結(jié)論HBV截短C基因融合preS1基因可在恥垢分枝桿菌中表達；帶有融合基因的重組恥垢分枝桿菌可誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生