1、目的：應用RNA干擾技術降低前列腺癌22RV1細胞株Raptor和Rictor基因表達水平,達到沉默mTORC1和mTORC2的目的,并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。研究哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的2種復合體mTORC1和mTORC2在前列腺癌22RV1細胞增殖及凋亡中的作用,并探索其機制及意義。
　　方法：針對Raptor和Rictor基因設計合成siRNA,鑒定和測序正確后轉(zhuǎn)染293T細胞觀察基因表達情況,構建人 Raptor-SiRNA、

2、Rictor-SiRNA慢病毒載體;包裝病毒并進行病毒滴度測定;嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的22RV1細胞株;噻唑藍(MTT)比色法檢測mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1細胞增殖改變;流式細胞術(FCM)檢測mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1細胞凋亡;Western blot檢測mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1細胞Raptor、Rictor、Akt、p-Akt和雄激素受體(AR)表達。<

3、br>　　結(jié)果：Raptor-SiRNA、Rictor-SiRNA慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染前列腺癌22RV1細胞后,經(jīng)嘌呤霉素篩選,獲得了穩(wěn)定沉默 mTORC1和mTORC2的細胞株。MTT顯示mTORC1沉默后,前列腺癌22RV1細胞的生長率無明顯變化(P>0.05),而mTORC2沉默后,細胞的增殖受到了顯著抑制(P<0.01);FCM顯示mTORC1沉默后,細胞的凋亡率明顯增加(P<0.01),而 mTORC2沉默后,細胞的凋亡率無明顯

4、變化(P>0.05);Western blot檢測顯示:轉(zhuǎn)染 Raptor-SiRNA或 Rictor-SiRNA的細胞株Raptor或Rictor表達水平均明顯低于對照組(P<0.05);mTORC1沉默后,前列腺癌22RV1細胞中AR和Akt磷酸化表達顯著增加(P<0.05),而mTORC2沉默后則顯著抑制了前列腺癌22RV1細胞中AR和Akt磷酸化表達(P<0.05)。
　　結(jié)論：成功構建了穩(wěn)定沉默mTORC1和mTORC2