1、植物絡合素(Phytochelatins，PCs)是在植物細胞內(nèi)廣泛存在的一種可以有效螯合Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金屬離子的多肽類化合物，其具有高度保守的一級結構:(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2～11)。在植物和酵母細胞內(nèi)，PCs對游離重金屬離子的富集和解毒過程具有重要作用，而植物絡合素合酶(Phytochelatin synthase，PCS)是催化其合成的關鍵酶。本實驗研究以Pb2+脅迫條件下的苦蕎葉片轉錄組數(shù)據(jù)為

2、基礎，通過RT-PCR克隆了苦蕎植物絡合素合酶(FtPCS)基因CDs序列和DNA序列，并對其進行了一系列的生物信息學分析。隨后，將獲得的苦蕎FtPCS基因CDs序列分別轉化E.coli BL21Star(DE3)、釀酒酵母YK44突變體菌株、以及擬南芥植株進行異源表達，并對其在重金屬Cd2+脅迫條件下的功能和表達特點進行分析，以期為進一步揭示FtPCS在苦蕎植物重金屬富集和解毒過程中的機制奠定基礎。本研究得到的主要結論有:
　　

3、(1)苦蕎植物絡合素合酶（FtPCS）基因的CDs序列長1485bp，編碼494個氨基酸，預測分子量為55.10kDa;FtPCS基因的DNA序列長5456bp，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，且內(nèi)含子兩側的剪接位點均滿足GT-AG規(guī)則。生物信息學分析表明，F(xiàn)tPCS基因氨基酸序列N-端序列高度保守，包括5個保守的Cys-殘基特征位點，是FtPCS蛋白活性中心;C-端序列包含12個可變的Cys-殘基位點，是主要的重金屬離子結合位點。

4、>　　(2)通過NEBuilder HiFi DNA Assembly技術，構建pET28a-PCS重組表達載體，轉化E.coli BL21Star(DE3)并通過IPTG誘導表達。可溶性分析結果表明，F(xiàn)tPCS在E.coli內(nèi)以包涵體的形式大量表達。通過Co2+螯合層析結合梯度透析復性，獲得了純化的FtPCS蛋白;通過反向-HPLC結合DTNB[5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]柱后衍生的方法，對FtPCS重組蛋白在Pb2+存在條

5、件下的催化活性進行分析。結果表明，純化的FtPCS蛋白具有催化活性，能將還原型谷胱甘肽(GSH)絡合生成PC化合物，而低濃度的Pb2+對其活性具有激活作用。
　　(3)通過NEBuilder HiFi DNA Assembly技術，構建pYES2-PCS酵母表達載體，轉化對重金屬離子Zn2+/Cd2+/Ni2+/Co2+敏感的釀酒酵母YK44突變體菌株，并通過半乳糖誘導表達。酵母功能互補實驗結果表明，在不同濃度Cd2+脅迫條件下，

6、轉化pYES2-PCS重組質(zhì)粒的酵母菌株比轉化空載的酵母菌株對重金屬Cd2+的耐受性明顯提高。在Cd2+脅迫條件下的酵母生長曲線同樣表明，F(xiàn)tPCS基因在酵母細胞中的表達，能夠彌補其重金屬抗性基因的缺陷，從而提高其對Cd2+的抗性。
　　(4)構建pCAMBIA3301-PCS植物表達載體，轉化農(nóng)桿菌GV3101，并通過花序浸染法轉化擬南芥植株。通過Basta篩選和PCR擴增鑒定，目前已獲得部分T2代陽性轉基因株系。該研究結果為進