1、第一部分、慢病毒介導MED19 shRNA載體構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建MED19的shRNA重組慢病毒載體,并包裝慢病毒顆粒。
　　 方法:使用Ambion公司的RNA干擾引物設(shè)計軟件對MED19靶點序列進行設(shè)計;將設(shè)計的序列進行合成載體構(gòu)建;挑選陽性和測序正確的質(zhì)粒進行病毒包裝;將包裝的慢病毒感染人肝癌細胞,并用qPCR和Western blotting的方法驗證人肝癌細胞內(nèi)MED19的基因是否被沉默。
　　 結(jié)

2、果:MED19 shRNA重組慢病毒載體構(gòu)建成功,qPCR和Western blotting結(jié)果顯示,實驗設(shè)計的第一條靶點序列在人肝癌細胞HepG2和Hep3B細胞內(nèi)沉默表達MED19的效果良好,敲減效率達到80％以上。
　　 結(jié)論:MED19的shRNA重組慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝成功。
　　 第二部分、沉默MED19表達對人肝癌細胞的生物學影響
　　 目的:探討沉默MED19表達對人肝癌細胞的生物學影響。<

3、br>　　 方法:設(shè)計實驗組:用MED19 shRNA重組慢病毒感染人肝癌細胞,用MTT的方法檢測MED19沉默表達后,人肝癌細胞的增殖能力的變化;用BrdU的方法檢測下調(diào)MED19表達后,人肝癌細胞DNA合成速度;用克隆形成的方法驗證MED19敲減后,人肝癌細胞的克隆形成能力變化;采用流式檢測各實驗組的細胞周期,觀察各實驗組細胞的周期情況。建立人肝癌移植小鼠模型,研究MED19基因沉默對人肝癌細胞成瘤能力的影響。
　　 結(jié)果

4、:重組的MED19 shRNAl慢病毒載體作用人肝癌細胞HepG2和Hep3B細胞后,下調(diào)MED19表達,HepG2細胞和Hep3B細胞的增殖能力被顯著抑制,這兩株細胞的DNA復制水平也顯著降低,并且抑制細胞的克隆形成能力,MED19基因被敲減后細胞周期被阻滯在G0/G1期。體內(nèi)研究結(jié)果表明,MED19沉默導致Hep3B肝癌細胞的成瘤能力顯著降低。
　　 結(jié)論:MED19對肝癌細胞異常增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用,MED19 shRN