1、目的：體內外分別檢測NANOG基因在不同病理級別膠質瘤組織和U87膠質瘤細胞系中的表達,探討NANOG基因在膠質瘤生物學行為中的作用,并構建NANOG慢病毒RNAi載體,為后續(xù)進一步體內外研究干擾NANOG基因表達對膠質瘤細胞生物學活性的影響奠定基礎。
　　方法：(1)采用免疫組織化學染色法、Western blot和RT-PCR方法從蛋白和mRNA水平檢測50例不同病理級別膠質瘤組織和7例正常腦組織標本中NANOG的表達。(2)

2、無血清懸浮培養(yǎng)法從 U87膠質瘤細胞系分離培養(yǎng) BTSCs,采用單克隆形成實驗純化BTSCs,觀察BTSCs在體外的增殖和分化,通過免疫細胞熒光染色法鑒定其干細胞特性;免疫細胞化學染色、Western blot和RT-PCR方法檢測U87腫瘤細胞及其BTSCs中NANOG的表達。(3)按照RNA干擾序列設計原則結合慢病毒載體質粒 pLKO.1-puro結構的特征設計合成 shRNA序列,通過分子克隆技術構建NANOG基因 RNA干擾慢病

3、毒載體 pLKO.1-NANOG-shRNA,連同包裝質粒pCMV-dR8.2 dvpr和包膜質粒pCMV-VSV-G共同轉染293T包裝細胞,收集儲存可表達NANOG特異性shRNA慢病毒載體的病毒顆粒并進行滴度測定。
　　結果：(1)NANOG蛋白在膠質瘤組織WHOⅡ級、Ⅲ級和IV級中的差異有統(tǒng)計學意義(F=14.918,P=0.000),NANOG mRNA的相對含量在膠質瘤組織WHOⅡ級、Ⅲ級、IV級中的差異有統(tǒng)計學意義(

4、F=65.901,P=0.000),NANOG蛋白和mRNA表達水平隨著病理級別增高而升高,而在正常腦組織中均未見表達。(2)利用無血清懸浮培養(yǎng)法從U87膠質瘤細胞系中成功分離培養(yǎng)出BTSCs,具有自我更新與增殖能力,表達特異性干細胞標記物CD133,在SCM中BTSCs發(fā)生貼壁分化,表達神經元和星形膠質細胞的特異性標記物NSE和GFAP。NANOG蛋白水平在U87腫瘤細胞和BTSCs中的差異有統(tǒng)計學意義(t=5.719,P=0.000

5、),NANOG mRNA相對含量在U87腫瘤細胞和BTSCs中的差異有統(tǒng)計學意義(t=4.770,P=0.000),BTSCs的NANOG蛋白和mRNA表達水平高于U87腫瘤細胞。(3)構建的NANOG基因RNA干擾慢病毒載體pLKO.1-NANOG-shRNA經PCR鑒定和測序,結果與設計序列完全相符,慢病毒重組體構建成功,將pLKO.1-NANOG-shRNA、pCMV-dR8.2 dvpr和pCMV-VSV-G三質粒共同轉染293

6、T包裝細胞后,收獲病毒并測定病毒滴度為106TU/ml。
　　結論：(1)NANOG在膠質瘤組織中高表達,表達水平隨著病理級別增高而升高,而在正常腦組織中均未見表達。(2)U87膠質瘤細胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的BTSCs;NANOG在U87膠質瘤細胞系中高表達,在BTSCs中表達水平高于U87腫瘤細胞。(3)成功構建了慢病毒RNAi載體pLKO.1-NANOG-shRNA,測序驗證構建成功,并完成了病毒的包裝、儲存和