1、第一部分:TLR3與乳腺癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究和功能論證
　　Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)家族是近年新發(fā)現(xiàn)一類信號通路基因,早先被認(rèn)為是天然免疫模式識別的主要受體,并控制著由天然免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)變。TLR信號通路并不是單一的直線傳導(dǎo),而是與多個信號通路之間存在著交聯(lián)和融合,組成了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。最近的研究顯示,不僅外源性分子,許多內(nèi)源性分子也能經(jīng)TLRs信號傳導(dǎo)途徑激活免疫應(yīng)答。其家族成員

2、之一,Toll樣受體3(TLR3)所介導(dǎo)的通路中有兩個關(guān)鍵基因核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-kappa B)和B細(xì)胞編碼k輕鏈多肽基因抑制激酶E(IKBKE)被證實與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān),但對于該通路關(guān)鍵基因TLR3和IKBKE在乳腺癌發(fā)生中的研究尚處于空白。因此在第一部分研究中我們選取TLR3所介導(dǎo)的通路中的三個關(guān)鍵基因TLR3、IKBKE和Toll樣受體接頭分子1(TICAM1)作為乳腺癌易感候選基因,并選取三個基因中的17個SNP

3、位點進(jìn)行分型及關(guān)聯(lián)分析。首先,我們通過一期病例對照研究(n=2,303例)發(fā)現(xiàn)三個TLR3基因多態(tài)與散發(fā)性乳腺癌顯著相關(guān)。這三個位點為rs5743305、rs5743312、rs3775296,分別位于TI,R3啟動子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和5'非翻譯區(qū)(5'UTR)。其中TLR3啟動子區(qū)域SNP rs5743305的-926bpA等位基因能顯著增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險,OR為1.220(95％CI為1.059-1.407,P=0.007);rs574

4、3312的T等位基因型能顯著增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險,OR為1.173(95％CI為1.046-1.315,P=0.006),rs3775296的+95T等位基因型能顯著增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險,OR為1.159(95％CI為1.036-1.298,P=0.011)。這些一期研究中的發(fā)現(xiàn),在第二期以家族性/早發(fā)性人群為主的病例對照研究中得到了進(jìn)一步驗證(n=1,248)。兩期研究(n=3,551)的聯(lián)合P值分別是1.97×10-4(rs5743

5、305)、7.01×10-5(rs5743312)和8.69×10-5(rs3775296)。我們發(fā)現(xiàn)風(fēng)險位點僅集中在TLR3基因中,進(jìn)而我們研究了位于該基因啟動子-926bp區(qū)域具有潛在功能意義的位點一rs5743305的作用機制。通過瞬時轉(zhuǎn)錄和熒光活性檢測,我們在不同的細(xì)胞系里均觀察到相似的趨勢,即風(fēng)險等位基因-926A相對于保護(hù)型等位基因-926T能夠使轉(zhuǎn)錄降低活性30-50％。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中,這種差別

6、具有統(tǒng)計學(xué)差異。第一部分的研究提示TLR3是一個乳腺癌易感基因,TLR3的基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生相關(guān),其啟動子區(qū)域的-926A＞T多態(tài)的低轉(zhuǎn)錄活性等位基因(A-allele)與分子流行病學(xué)的風(fēng)險型等位基因(A-allele)一致,提示TLR3高表達(dá)可能降低乳腺癌風(fēng)險。
　　第二部分:TLR3基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及機制探討
　　第一部分研究對TLR3介導(dǎo)的通路中的關(guān)因TLR3、IKBKE、TICAM1與乳腺癌的

7、發(fā)生進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析及功能論證,初步揭示該通路中與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險基因主要集中在TLR3基因上。通過對其啟動子區(qū)域風(fēng)險多態(tài)-926bpA＞T的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn),TLR3表達(dá)降低與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)。這向我們提示TLR3基因本身對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的影響。目前TLR3的研究多數(shù)集中在TLR3信號參與的腫瘤免疫調(diào)節(jié),主要通過MyD88-IRAK-TRAF6-NF-kappaB途徑影響免疫相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)揮抗腫瘤作用。近期越來越多的研究發(fā)

8、現(xiàn)TLR3在腫瘤發(fā)生的不同階段、不同腫瘤甚至相同腫瘤不同細(xì)胞系中發(fā)揮不同的作用。關(guān)于TLR3在乳腺癌中的地位的研究幾近空白,因此有理由對TLR3基因在乳腺癌中的地位及可能的作用機制進(jìn)行進(jìn)一步研究。該部分中,我們構(gòu)建了TLR3表達(dá)質(zhì)粒,建立人乳腺癌TLR3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過體內(nèi)、體外實驗研究觀察TLR3對人乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。并在臨床標(biāo)本中觀察TLR3基因的表達(dá)對生物學(xué)表型的影響。體外實驗結(jié)果顯示:TLR3穩(wěn)定

9、高表達(dá)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制;細(xì)胞S期比例降低,細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯;運動與侵襲能力減弱。體內(nèi)實驗得到了進(jìn)一步證明:高表達(dá)TLR3基因細(xì)胞的移植瘤成瘤的時間晚于對照組,生長速度和腫瘤體積明顯減小。進(jìn)一步對機制的研究發(fā)現(xiàn):TLR3的高表達(dá)可通過Caspase家族和Bcl-2家族共同調(diào)控促進(jìn)凋亡,并抑制EGFR/PI3K/AKT通路活性。最后,我們在組織標(biāo)本中證實正常乳腺組織中比癌組織中TLR3表達(dá)水平更高?？傊?我們的研究提示TLR3至少