1、水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是彈狀病毒科的原型病毒，為有包膜的負(fù)鏈RNA病毒。由于它可以在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制而被用于腫瘤治療，在多種腫瘤模型中都表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，因此VSV是一種較有前途的溶瘤病毒。但可復(fù)制的溶瘤病毒應(yīng)用于腫瘤臨床治療始終存在著安全隱患，因此有必要探尋更為安全的利用病毒治療腫瘤的方法。文獻(xiàn)報(bào)道，在VSV病毒編碼的五種蛋白中基質(zhì)(Matrixprotein，M)蛋白在

2、VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變中起著重要的作用，如：引起細(xì)胞變圓和細(xì)胞凋亡，而且在沒(méi)有VSV其他蛋白成分存在的情況下M蛋白仍然可以引起細(xì)胞這些特征性病變?；贛蛋白的這一重要功能，同時(shí)為了避免復(fù)制完全型病毒在臨床治療中可能面臨的諸多問(wèn)題，我們?cè)O(shè)想將VSV病毒的功能基因-M蛋白基因用于腫瘤的基因治療研究中，通過(guò)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)M蛋白基因?qū)霗C(jī)體后表達(dá)的M蛋白又可以激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而使M蛋白的抗腫瘤作用增強(qiáng)。

3、 為了探討這一假設(shè)，我們構(gòu)建了含有VSV M蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-M，簡(jiǎn)稱為(p-m)，經(jīng)酶切、RT-PCR測(cè)序鑒定M基因插入正確，體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后48～72小時(shí)收獲細(xì)胞，RT-PCR、western blot檢測(cè)到M蛋白的體外表達(dá)。在體外的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549、小鼠Lewis肺癌LL／2c、人結(jié)腸腺癌SW480、小鼠結(jié)腸腺癌CT26，倒置顯微鏡下可以觀察到明顯的細(xì)胞

4、形態(tài)學(xué)改變，MTT檢測(cè)與對(duì)照各組包括空載體轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體單純處理組和不處理組相比，M蛋白轉(zhuǎn)染組可以觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48小時(shí)PI染色的熒光顯微鏡觀察到典型的細(xì)胞凋亡時(shí)相核改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到亞G1期細(xì)胞明顯增高，也提示腫瘤細(xì)胞凋亡。接下來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中我們進(jìn)行了成瘤性實(shí)驗(yàn)和治療性實(shí)驗(yàn)。成瘤性實(shí)驗(yàn)采用MethA纖維肉瘤模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分3組，腫瘤細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-M(M組)、pcDNA3.1空載(P組)及不處

5、理的對(duì)照(N組)，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)用1×10<'6>細(xì)胞皮下接種BALB／c小鼠，結(jié)果20天后M組未觀察到腫瘤形成，而N組和P組腫瘤平均達(dá)到了1000mm<'3>。在LL／2c、CT26及MethA治療模型中，我們觀察到已建立的腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，腫瘤生長(zhǎng)緩慢甚至停止，在MethA模型中腫瘤明顯消退，荷瘤小鼠生存期明顯延長(zhǎng)。Cr<'51>釋放試驗(yàn)觀察到來(lái)源于脂質(zhì)體M蛋白質(zhì)粒復(fù)合物治療組的脾細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的腫瘤細(xì)胞特異性的CTL活性，且這種殺傷

6、活性能夠被抗CD8<'+>和MHC-I類單抗阻斷，但不能被抗CD4<'+>和MHC-II單抗阻斷。淋巴細(xì)胞過(guò)繼實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抗腫瘤免疫反應(yīng)主要依賴于CD8<'+>T淋巴細(xì)胞。HE染色可以看到M蛋白治療組中有大片腫瘤組織壞死，TUNEL染色檢測(cè)到大量的腫瘤細(xì)胞凋亡。 我們的研究首次將VSV的基質(zhì)蛋白基因-M基因用于腫瘤基因治療，觀察到明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤生長(zhǎng)抑制，延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存時(shí)間，同時(shí)激發(fā)了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此我們