1、[目的]： 研究腺病毒介導(dǎo)的重組IL2-KDRscFv、IL2-sTRAIL(114-281aa)及IL2-KDRscFv-sTRAIL對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞、肝癌HepGⅡ細(xì)胞、大腸癌SW480細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞株LO2的殺傷作用，以及對(duì)裸鼠腫瘤體積、腫瘤微血管生成的抑制作用，觀察KDRscFv融合sTRAIL是否有協(xié)同抗瘤效果，為應(yīng)用TRAIL進(jìn)行腫瘤基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法]： 采用重疊延伸PCR

2、方法，分別在KDRscFv及sTRAIL(114-281aa)基因的N端融合IL2信號(hào)肽基因，以提高蛋白表達(dá)的可溶性。然后采用基因融合技術(shù)，構(gòu)建IL2-KDRscFv與sTRAIL的融合基因。根據(jù)細(xì)菌內(nèi)同源重組原理，首先構(gòu)建編碼TRAIL胞外區(qū)114～281位氨基酸、編碼KDR單鏈抗體及編碼二者融合基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-IL2-KDRscFv、pAd-IL2-sTRAIL及pAd-IL2-KDRscFv-sTRAIL，酶切線性化后

3、轉(zhuǎn)染BJ5183菌，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasv-1在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生同源重組，將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)染HEK293人胚腎細(xì)胞，獲得高滴度的重組病毒顆粒后，轉(zhuǎn)導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人肝癌細(xì)胞株HepGⅡ和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480以及人正常肝細(xì)胞株LO2，并采用荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)注射的方法，通過流式細(xì)胞儀、MTT、Western印跡法和免疫組化等方法測(cè)定重組腺病毒介導(dǎo)的目的蛋白在體內(nèi)外的表達(dá)及觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和對(duì)腫瘤體積、腫瘤血管生成的

4、抑制作用。 [結(jié)果]： (1)成功地獲得了三種重組腺病毒，在293細(xì)胞中大量擴(kuò)增后，經(jīng)氯化銫純化濃縮后病毒滴度可達(dá)1012vp/ml。且均對(duì)真核細(xì)胞有高效感染效率。 (2)三種重組腺病毒對(duì)SGC-7901、SW480和HepGⅡ細(xì)胞均有一定程度的凋亡誘導(dǎo)作用，其中以重組Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最為明顯。在感染復(fù)數(shù)為20，作用48小時(shí)情況下，可誘導(dǎo)39.16％的肝癌HepGⅡ細(xì)胞發(fā)生凋

5、亡，與PBS及Ad-GFP對(duì)照組相比，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (3)三種腫瘤細(xì)胞中，以肝癌HepGⅡ細(xì)胞對(duì)負(fù)載有目的基因的腺病毒最為敏感，在感染復(fù)數(shù)為20，作用48小時(shí)情況下，Ad-IL2-sTRAIL可誘導(dǎo)19.88％、Ad-KDRsvFv可誘導(dǎo)9.09％的HepGⅡ細(xì)胞凋亡，同樣條件下胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率分別為8.09％、5.75％。 (4)三種腺病毒對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2無(wú)明顯凋亡誘導(dǎo)作用，與PBS對(duì)照

6、及Ad-GFP載體對(duì)照組相比，結(jié)果無(wú)顯著差別。 (5)三種腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)上清及收集的細(xì)胞沉淀中均可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。 (6)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，瘤體內(nèi)注射重組腺病毒，可明顯抑制腫瘤體積增長(zhǎng)，以Ad-IL-2-KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最為明顯，抑瘤率達(dá)75.60±4.8891％，而Ad-IL2-sTRAIL及Ad-IL2-KDRscFv的抑瘤率分別為63.69±6.6706％和56.17±7.

7、3983％。 (7)瘤體內(nèi)注射重組腺病毒，可使腫瘤組織微血管密度減少，以Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL腺病毒的作用最為明顯，與其它治療組及對(duì)照組相比，結(jié)果具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (8)瘤體內(nèi)注射腺病毒，僅在肝組織及腫瘤組織中檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，心、脾、腎、小腸、肺等組織為陰性表達(dá)。 (9)各組裸鼠的肝臟組織及其他組織經(jīng)病理切片觀測(cè)，未見到明顯的病理改變。 [結(jié)論]： (1)重組腺病毒介導(dǎo)

8、的IL2-KDRscFv、IL2-sTRAIL(114-281aa)及IL2-KDRscFv-sTRAIL對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞、肝癌HepGⅡ細(xì)胞及大腸癌sW480細(xì)胞均有殺傷作用，其中以Ad-IL2-KDRscFv-sTRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。 (2)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們構(gòu)建的三種腺病毒對(duì)人正常肝細(xì)胞株LO2是安全的。 (3)瘤體內(nèi)注射腺病毒，可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤微血管生成，以Ad-IL2-KDR