1、背景與目的： 炎癥是人類(lèi)多種疾病中一種最常見(jiàn)的病理過(guò)程，可發(fā)生于機(jī)體的任何部位和組織，是機(jī)體對(duì)感染或創(chuàng)傷等引起的內(nèi)環(huán)境紊亂的正常反應(yīng)。但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥，導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞自身性損害，表現(xiàn)為膿毒癥，膿毒性休克甚至多器官功能障礙綜合征。臨床上革蘭氏陰性菌感染引起的炎癥反應(yīng)損傷是一種常見(jiàn)疾病，往往難于控制，嚴(yán)重時(shí)可引起內(nèi)毒素血癥或感染性休克，危及病人生命。革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的活性成分內(nèi)毒素即脂多糖(LPS)是

2、引發(fā)急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵致病物質(zhì)，它能激活機(jī)體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。新近發(fā)現(xiàn)并廣為研究的Toll樣受體2(TLR2)與LPS引起的免疫反應(yīng)及其導(dǎo)致的機(jī)體損傷有很大的關(guān)系，TLR2識(shí)別的配體最多，參與人體內(nèi)對(duì)LPS的反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥信號(hào)傳入胞內(nèi)激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，在識(shí)別各種病原微生物引發(fā)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中扮演重要的角色?，F(xiàn)已證實(shí)多種致炎細(xì)菌成分都直接或間接激活TLR2繼而使白細(xì)胞活化，白細(xì)胞活化后，

3、一方面殺滅細(xì)菌，另一方面又釋放多種致炎介質(zhì)和細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，劇烈過(guò)度的全身性炎癥反應(yīng)則可影響多個(gè)臟器并最終導(dǎo)致不可逆的病理?yè)p傷。因此，阻斷或抑制TLR2的激活，則有可能抑制白細(xì)胞的活化，阻斷白細(xì)胞炎性介質(zhì)的合成與分泌，避免多種細(xì)菌成分導(dǎo)致的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由于可溶性TLR2胞外區(qū)蛋白(sTLR2)具有和白細(xì)胞膜上天然的TLR2受體胞外區(qū)相同的與細(xì)菌成分相結(jié)合的能力，理論上sTLR2可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制白細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的激活，從

4、而阻止白細(xì)胞活化和釋放炎性介質(zhì)進(jìn)而達(dá)到抗炎治療的目的?；诖耍緦?shí)驗(yàn)采用腺病毒表達(dá)策略，首先克隆人TLR2胞外區(qū)基因，然后制備攜帶TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體，獲得可以表達(dá)sTLR2的高滴度純化病毒，觀察重組腺病毒介導(dǎo)sTLR2在動(dòng)物模型體內(nèi)的抗炎作用，以探明sTLR2的抗炎機(jī)制，為急性炎癥反應(yīng)的防治提供新的思路和治療策略。 研究方法： 1.分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取其RNA作為模板采用RT-PCR方法擴(kuò)增人

5、TLR2胞外區(qū)cDNA。目的基因經(jīng)純化后將其亞克隆至pUCm-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-TLR2，選取鑒定正確的克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列進(jìn)行同源性比較分析。 2.將測(cè)序正確的TLR2胞外區(qū)目的片段定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR2，將陽(yáng)性重組子酶切線性化后轉(zhuǎn)化感受態(tài)AdEasier-1細(xì)菌，在E.coli BJ5183內(nèi)與腺

6、病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2。 3.將鑒定正確的重組質(zhì)粒pAd-TLR2以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中進(jìn)行包裝并且擴(kuò)增病毒。觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，純化并測(cè)定病毒滴度，以PCR方法鑒定重組腺病毒并進(jìn)行野生型病毒檢測(cè)分析其應(yīng)用的安全性。 4.建立致死劑量LPS所致炎癥動(dòng)物模型：40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A和B兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，重組腺病毒AdTLR2于致炎之前(A實(shí)驗(yàn)

7、組)和致炎之后(B實(shí)驗(yàn)組)分別作用于炎癥小鼠，觀察其對(duì)小鼠生存時(shí)間的影響。 5.建立小劑量LPS所致炎癥動(dòng)物模型；40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組(尾靜脈注射0.9％生理鹽水)、炎癥對(duì)照組(腹腔緩慢注射小劑量LPS溶液)、重組腺病毒AdTLR2 A組(LPS致炎之前尾靜脈注射病毒懸液)、重組腺病毒AdTLR2B組(LPS致炎之后尾靜脈注射病毒懸液)。觀察48h后，摘眼球取血，分離血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELIS

8、A)對(duì)血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量變化進(jìn)行檢測(cè)，探討AdTLR2對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平變化的影響。 結(jié)果： 1.從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中應(yīng)用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增TLR2胞外區(qū)cDNA，并且成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-TLR2。 2.經(jīng)測(cè)序及序列同源性比較，本實(shí)驗(yàn)所克隆的目的片段長(zhǎng)度為1764bp，測(cè)序結(jié)果無(wú)堿基突變與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列完全吻

9、合。 3.經(jīng)雙酶切及DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)插入序列和讀碼框架正確，重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR2構(gòu)建成功。 4.重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒通過(guò)在E.coli BJ5183內(nèi)的同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2，經(jīng)Pac I酶切后可見(jiàn)一條約30kb大小的條帶和一條4，5kb的特征性條帶，表明同源重組成功。 5.將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可以

10、觀察到明亮的綠色熒光，并且出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，說(shuō)明重組腺病毒包裝成功。 6.擴(kuò)增后收集病毒，經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化獲得3x109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒AdTLR2，以PCR鑒定其攜帶有所克隆入的TLR2胞外區(qū)目的基因，并且經(jīng)檢測(cè)無(wú)野生型病毒存在。 7.BALB/c小鼠經(jīng)腹腔注射LPS后成功復(fù)制內(nèi)毒素血癥炎癥動(dòng)物模型，制備的重組腺病毒AdTLR2對(duì)小鼠無(wú)明顯的毒

11、性作用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)病毒耐受良好。 8.重組腺病毒AdTLR2作用于致死劑量LPS所致炎癥動(dòng)物模型后，A實(shí)驗(yàn)組和B實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間與炎癥對(duì)照組比較相對(duì)延長(zhǎng)。 9.重組腺病毒AdTLR2作用于小劑量LPS所致炎癥動(dòng)物模型后，AdTLR2 A組和AdTLR2 B組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的血清水平均較炎癥對(duì)照組有所降低，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AdTLR2 A組與AdTLR

12、2 B組數(shù)據(jù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1.成功克隆TLR2胞外區(qū)基因cDNA全部編碼序列，經(jīng)測(cè)序及序列同源性比較，證實(shí)目的基因無(wú)堿基突變與GenBank中所提供的相關(guān)序列完全吻合。 2.應(yīng)用AdEasy System腺病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建攜帶有TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體AdTLR2，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、純化后獲得3×109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒，此在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。