1、第一章、一種改進(jìn)的大鼠胎肝干細(xì)胞分離純化方法
　　 背景：干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，存在于許多組織中;根據(jù)其發(fā)育階段不同分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。肝干細(xì)胞(hepatic stemcell，HSC)是成體干細(xì)胞的一種，可分化為成熟肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和胰腺上皮細(xì)胞。跟據(jù)其起源的不同，可分為肝源性肝干細(xì)胞和非肝源性肝干細(xì)胞，前者主要包括肝卵圓細(xì)胞、小肝細(xì)胞，后者主要起源于骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。目前研究肝

2、干細(xì)胞已成為世界范圍的熱點，由于它具有來源廣泛、增殖能力強(qiáng)、移植細(xì)胞體積小等傳統(tǒng)肝細(xì)胞無可比擬的優(yōu)點，可以預(yù)測它將替代肝臟移植和肝細(xì)胞移植成為治療器官衰竭的一種重要細(xì)胞來源。正是由于肝干細(xì)胞治療各種原因引起的肝病具有無可比擬的優(yōu)勢，因此探討如何獲得高純度的肝干細(xì)胞及其特異性的標(biāo)志物有重要的現(xiàn)實意義。
　　 正常情況下，體內(nèi)肝干細(xì)胞多處于靜息期，數(shù)量極少，分離時常先經(jīng)藥物或手術(shù)造成肝臟損傷，肝臟灌流或聯(lián)合細(xì)胞分離液分離來獲得肝干細(xì)

3、胞，操作復(fù)雜且成本較高。相比較傳統(tǒng)的肝干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法而言，本實驗室首次采用先機(jī)械剪碎酶消化法分離獲得肝干細(xì)胞，簡單的離心分離法和胰蛋白酶選擇性消化法相結(jié)合，從孕15天大鼠胎肝組織中成功分離出肝干細(xì)胞。此方法在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的LSCs，且具有操作簡單、快捷、實用、對細(xì)胞損傷小等優(yōu)點，為其作為組織工程種子細(xì)胞提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 改進(jìn)大鼠胎肝干細(xì)胞的分離純化方法，提高肝臟干細(xì)胞

4、分離的純度和活力。
　　 方法：
　　 1、購清潔級別近交系孕15天SD大鼠，利用械剪碎酶消化法分離獲得肝干細(xì)胞，后經(jīng)簡單的離心分離法以及胰蛋白酶選擇性消化法進(jìn)行進(jìn)一步的純化，得到較為純化的肝干細(xì)胞。加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況及形態(tài)學(xué)變化。
　　 2、將卵圓細(xì)胞接種于預(yù)先用0.2％明膠處理的蓋玻片上置于24孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時，至細(xì)胞長成單層后行

5、免疫熒光化學(xué)檢測。細(xì)胞消化傳代，對P10代細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。分別檢測P1和P10代肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、C-Kit、OV6、CK19的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：分離的大鼠胎肝干細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶24 h后開始貼壁，5d后細(xì)胞體積增大，呈梭形或多邊形。經(jīng)1～2次差異性消化傳代后，細(xì)胞呈集落樣生長，邊緣清晰且折光率強(qiáng)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測示:P1代大鼠胎肝干細(xì)胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、細(xì)胞角蛋白(CK)19呈

6、陽性表達(dá)，不表達(dá)ALB。P10代肝干細(xì)胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 此方法在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的LSCs，且具有操作簡單、快捷、實用、對細(xì)胞損傷小等優(yōu)點，為深入研究肝干細(xì)胞生物學(xué)特性和進(jìn)行體內(nèi)移植實驗提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 第二章、大鼠肝損傷后成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞在肝再生中的作用
　　 背景：長期以來，成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞在損傷肝的再生

7、中如何發(fā)揮作用一直是肝干細(xì)胞研究領(lǐng)域的核心問題，對兩者在損傷肝再生中的作用也有著不同的觀點。一方面，有報道認(rèn)為部分肝切除(partial hepatectomy，PH)后大鼠肝可在二周內(nèi)再生并恢復(fù)至原來大小，有人連續(xù)進(jìn)行了12次PH后發(fā)現(xiàn)仍能完成肝再生:這種肝再生多被認(rèn)為是單獨由成熟肝細(xì)胞分裂增殖完成的。另一方面，在損傷肝再生中發(fā)揮了作用的、起源于門管區(qū)小膽管和Hering's管的卵圓細(xì)胞(OVC)被認(rèn)為可能是肝內(nèi)源性的具有肝膽雙向分化

8、潛能的成體肝干細(xì)胞。目前，為研究成體肝臟中肝干細(xì)胞的增殖、分化，研究者們采用各種不同的方法抑制肝細(xì)胞增殖，并采用藥物（如CC14）或肝部分切除術(shù)等誘導(dǎo)肝臟急性損傷，以激活肝臟干細(xì)胞。從而研究肝損傷后成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞與肝臟再生的關(guān)系。
　　 本研究鑒于RS是公認(rèn)的能長期抑制成熟肝細(xì)胞分裂增生的肝化學(xué)毒劑，而PH又能給予強(qiáng)烈的肝再生需求，我們建立了肝臟切除及其聯(lián)合應(yīng)用倒千里光堿導(dǎo)致肝臟急性損傷的大鼠模型，通過對Rs/PH和1/3

9、PH后肝再生過程中成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞的比較病理學(xué)研究，并依據(jù)研究中觀察到的一系列現(xiàn)象，探討關(guān)于肝損傷后成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞與肝臟再生的關(guān)系。
　　 目的：
　　 聯(lián)合應(yīng)用倒千里光堿(RS)和肝臟1/3切除術(shù)(1/3PH)建立大鼠肝損傷模型。觀察大鼠肝損傷后肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞增殖情況，探討關(guān)于肝損傷后成熟肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞與肝臟再生的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、30只大鼠隨機(jī)分為2組，每組15只。倒千里光

10、堿/肝臟1/3切除組(RS/PH組):取150g左右SD大鼠，腹腔注射倒千里光堿溶液30 mg/kg，共注射2次，每次間隔2周。肝臟1/3切除組（1/3PH組）:用生理鹽水代替倒千里光堿，腹腔注射30 mg/kg，共注射2次，每次間隔2周，第2次腹腔注射4周后，兩組大鼠行肝臟1/3切除術(shù)。
　　 2、分別于術(shù)后第3、7、14、20天處死大鼠，10％甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，采用蘇木精-伊紅染色，BrdU注射及BrdU免疫熒光

11、化學(xué)檢測，CK19、C-Kit免疫組織化學(xué)檢測觀察兩組大鼠術(shù)后不同時間點肝臟病理形態(tài)變化、細(xì)胞增殖情況和CK19、C-kit免疫組化檢測情況。
　　 結(jié)果：RS/PH組大鼠術(shù)后20d體質(zhì)量仍低于術(shù)前，肝臟增大明顯小于1/3PH組，HE染色示胞體腫大、胞漿疏松、肝細(xì)胞廣泛空泡變性，匯管區(qū)小膽管周圍和肝小葉內(nèi)可見成簇或散在分布的卵圓細(xì)胞增生;1/3PH組術(shù)后20d體質(zhì)量恢復(fù)接近術(shù)前，肝臟損害較RS/PH組輕，Brdu免疫熒光示成熟肝

12、細(xì)胞大量增生，術(shù)后14d見肝OVC增生，多出現(xiàn)在肝細(xì)胞索中，形態(tài)和免疫組化標(biāo)記與RS/PH組OVC一致。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了倒千里光堿聯(lián)合肝臟1/3切除術(shù)的急性肝損傷大鼠模型，實驗可見肝臟中毒及中毒后肝干細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞增殖的現(xiàn)象，證實肝細(xì)胞更新與損傷后再生是肝流域中肝內(nèi)外源肝干細(xì)胞及成熟肝細(xì)胞共同作用的結(jié)果。
　　 第三章、GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及脾內(nèi)移植的初步研究
　　 背

13、景：各種原因引起的急、慢性肝功能衰竭的發(fā)病率和死亡率很高，已成為威脅肝病患者生命的主要原因。目前，原位肝移植(OLT)已被證明是治療各種肝功能失代償期、肝功能衰竭期最有效的治療方法，但因為肝源缺乏、費(fèi)用昂貴、以及移植后并發(fā)癥多等限制了OLT的廣泛應(yīng)用。近年來，新的干預(yù)性治療不斷出現(xiàn)，肝細(xì)胞移植已開始應(yīng)用于一些動物模型和人類臨床實驗，但由于肝細(xì)胞來源不充足，人們?nèi)匀幌Ｍ軌颢@得大量更安全的細(xì)胞來源。肝干細(xì)胞的移植為此開拓了新的途徑，肝干細(xì)

14、胞是一種多能干細(xì)胞，它具有自我更新、高度增殖及向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的能力，在體內(nèi)可以分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，參與肝臟的發(fā)生發(fā)育及損傷后修復(fù)等生理病理過程。若能將其大量擴(kuò)增后再進(jìn)行移植，就可能從量上解決細(xì)胞來源短缺的問題。
　　 肝干細(xì)胞移植相對于肝細(xì)胞具有更大的優(yōu)勢:(1)肝干細(xì)胞具有更大的增殖能力，植入受體后增殖能力強(qiáng)，較少的移植細(xì)胞數(shù)就能達(dá)到較好的增殖效果;(2)移植肝內(nèi)后能分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，對肝組織結(jié)構(gòu)重建及功

15、能恢復(fù)更為有利，更為重要的是，肝細(xì)胞增殖需要受肝存在選擇壓力，而肝干細(xì)胞在正常肝臟環(huán)境中就能大量增殖，為受體肝臟的再生及肝功能恢復(fù)提供機(jī)會;(3)肝干細(xì)胞分化不成熟，免疫原性更弱，Kubota等研究表明肝母細(xì)胞中不表達(dá)經(jīng)典的MHC-1分子，在肝干細(xì)胞同種異體移植時能引起免疫逃逸。移植失敗現(xiàn)象較肝細(xì)胞移植少，對受體影響小;(4)肝干細(xì)胞直徑(10-12tm)較肝細(xì)胞(20-35μm)小，更容易通過肝竇到達(dá)肝臟各葉，使其定植及擴(kuò)增效率增加。

16、而肝細(xì)胞移植濃度較高時部分細(xì)胞則不能通過匯管區(qū)小血管。因此肝干細(xì)胞可以作為生物型人工肝和肝細(xì)胞移植最理想的細(xì)胞來源，從而在肝病基因治療中發(fā)揮重要作用，并有望成為取代嚴(yán)重肝功能衰竭患者肝移植的替代療法，具有很大的研究前景。
　　 本研究對L-CL2MDP/RS/PH處理的大鼠進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞移植，結(jié)果表明本實驗室建立的肝干細(xì)胞系能夠成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝臟中，植入的細(xì)胞能夠在受體大鼠肝臟中存活，并

17、且出現(xiàn)不同程度的增殖。而在未作預(yù)處理的正常大鼠肝臟中未見GFP+肝干細(xì)胞。雖然我們并不能明確移植的胎肝干細(xì)胞在肝內(nèi)增殖程度，但從肝臟中GFP陽性的細(xì)胞比例比較，L-CL2MDP/RS/PH實驗組比正常對照組具有明顯的優(yōu)勢。說明L-CL2MDP/RS/PH模型能夠提供一個相對較好的肝干細(xì)胞植入的環(huán)境。這為研究適用于細(xì)胞移植的實驗動物模型提供了一些有價值的信息。今后我們將擴(kuò)展這一研究成果，努力與臨床實踐相結(jié)合，并回答移植研究中尚待解決的排斥

18、免疫學(xué)機(jī)制問題。
　　 目的：
　　 1、從熒光轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝中獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白的肝臟干細(xì)胞2、聯(lián)合應(yīng)用L-CL2MDP/RS/PH，建立適合肝臟干細(xì)胞移植的大鼠動物模型，進(jìn)一步提高肝干細(xì)胞的移植效率。
　　 方法:
　　 1、孕15d綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠，體重40-60g，SPF級150g左右SD雄性大鼠30只，GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)與傳代及免疫組化鑒定。
　

19、　 2、建立L-CL2MDP/RS/PH動物模型，將分離的胎肝干細(xì)胞通過脾臟注射移植到大鼠肝臟，檢測細(xì)胞移植后GFP蛋白的表達(dá)，以及免疫組化檢測C-Kit、AFP明確移植的肝干細(xì)胞在肝臟內(nèi)是否增殖。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡下見分離的肝干細(xì)胞大小均勻，呈鵝卵石形態(tài)。接種培養(yǎng)瓶24h細(xì)胞開始貼壁并伸展;培養(yǎng)5d后細(xì)胞體積增大，呈梭形或多角形，熒光顯微鏡可觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。傳代3次后，細(xì)胞狀態(tài)良好，在熒光顯

20、微鏡下可見炫目的綠色熒光，免疫組化檢測P3代細(xì)胞CD34、AFP呈陽性表達(dá)，。
　　 2、HSCs經(jīng)脾臟移植后3d在熒光顯微鏡下觀察兩組大鼠的肝臟冰凍切片，發(fā)現(xiàn)L-CL2MDP/RS/PH組大鼠肝內(nèi)散在分布GFP陽性細(xì)胞，細(xì)胞大小為正常肝細(xì)胞的1/3-1/2，與周圍細(xì)胞相比，呈現(xiàn)高亮度的綠色熒光;而對照組大鼠肝內(nèi)未見GFP陽性細(xì)胞。移植后30d移植大鼠肝臟內(nèi)仍可見GFP陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞成團(tuán)聚集、局灶狀分布，細(xì)胞形態(tài)與肝細(xì)胞相似

21、。
　　 結(jié)論：
　　 1、從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中成功分離出胎肝干細(xì)胞，分離的細(xì)胞原代形態(tài)均一、增殖速度快、傳代3次后均可以穩(wěn)定而強(qiáng)烈表達(dá)綠色熒光，為進(jìn)一步研究提供了良好的示蹤工具。
　　 2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型，植入的細(xì)胞能夠在受體大鼠肝臟中存活，并且出現(xiàn)不同程度的增殖。說明L-CL2MDP/RS/PH模型能夠提供一個相對較好的肝干細(xì)胞植入的環(huán)境。這為研究適用于細(xì)胞移植的實驗動物