1、本課題組在2004年5月,從中國東海北起上海崇明島南至福建南麂列島離岸35海里的區(qū)域采集了28個海水、海泥樣本,利用稀釋涂平板法從中分離得到1043株微生物樣本,并利用稻瘟霉模型作為活性初篩模型,得到216株對稻瘟霉具有較強(qiáng)抑制活性的菌株。本文隨機(jī)選取了30株稻瘟霉活性菌株用抗大腸桿菌模型進(jìn)行復(fù)篩得到活性菌株F81612,該菌株對大腸桿菌的生長表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性。 通過抽提細(xì)菌總DNA模板,PCR擴(kuò)增16S rDNA序列,Bl

2、ast比對并構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示F81612與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的進(jìn)化位置最為接近,它們的相似性高達(dá)99％。細(xì)菌革蘭染色、芽孢染色、培養(yǎng)特征、部分生化反應(yīng)的研究也顯示該菌具備枯草芽孢桿菌的基本特性,因此鑒定其為枯草芽孢桿菌。從細(xì)菌在各鹽濃度下生長曲線可以看出菌株F81612是一種中等嗜鹽菌,最適生長鹽度為10％。 利用Placket-Burman法和響應(yīng)曲面法對菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行摸索,以提高單位體

3、積活性物質(zhì)的產(chǎn)量,并通過統(tǒng)計學(xué)方法分析確定最大產(chǎn)活條件為：溫度29.9℃、初始pH值6.0、裝液量52.3％、振蕩頻率130 r/min、接種量10％、培養(yǎng)時間7 d;培養(yǎng)基配方：蛋白胨4 g、酵母提取物10 g,牛肉膏0.4 g,葡萄糖10 g,人工海水1000 mL。 小量發(fā)酵后發(fā)酵液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積充分萃取,分別測定對大腸桿菌的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性成分分布在乙酸乙酯萃取部分中,為中等極性物質(zhì)。搖瓶大規(guī)模發(fā)

4、酵得菌液60 L,離心除菌體后,上清用等體積乙酸乙酯充分萃取三次,減壓蒸干,最后得到乙酸乙酯浸膏24.6 g。對乙酸乙酯浸膏經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析及反相硅膠柱層析,然后以水-甲醇/乙腈洗脫系統(tǒng)經(jīng)HPLC純化制備,共得到了25個化合物,利用核磁共振和質(zhì)譜等技術(shù)并結(jié)合化合物理化性質(zhì)確定了其中12個化合物的結(jié)構(gòu),它們分別為:Macrolactin A, Maerolactin S,3-羥基乙酰基吲哚,3-吲哚乙醇,環(huán)(色-脯)二肽,環(huán)(異亮-色)二

5、肽,環(huán)(亮-脯)二肽,環(huán)(亮-纈)二肽,環(huán)(異亮-脯)二肽,環(huán)(苯丙-纈)二肽,N-苯乙基乙酰胺,對羥基苯甲醛。 化合物活性測定Macrolactin A對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為0.45μg/mI,和6.3μg/mL,Macrolactin S對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為0.2μg/mL和0.7μg/mL,兩者都能強(qiáng)烈抑制稻瘟霉孢子萌發(fā),MIC值分別為3.6μg/mL和2.2μg/mL,但抗腫瘤活