1、肝纖維化（hepatic fibrosis）是多種細(xì)胞及介質(zhì)參與的，針對各種肝損傷的損傷修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的主要特征是以Ⅰ型膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分異常沉積。Ⅰ型膠原蛋白主要來源于活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)。Ⅰ型膠原蛋白是由兩條α1鏈和一條α2鏈構(gòu)成的異三聚體，呈三螺旋結(jié)構(gòu)，COL1A1和COL1A2基因分別編碼其α1鏈和α2鏈。LX-2

2、細(xì)胞是人的肝星狀細(xì)胞系。
　　一、HBV對肝星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)調(diào)控研究
　　HBV感染者可以發(fā)生肝纖維化，但其分子機(jī)制仍未完全闡明。許多研究表明HBV感染肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growthfactor-β1，TGFβ1)等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于HSC膜受體，引起HSC活化。但涉及到HBV對HSC直接作用的研究并不多，很多問題有待解決，諸如HBV能否感染HSC，HBV是否影

3、響HSCⅠ型膠原蛋白的表達(dá)，其機(jī)制如何。本研究第一部分即針對這些問題進(jìn)行研究。
　　1.HBV對LX-2細(xì)胞的感染及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響
　　HBV能否感染LX-2細(xì)胞。將LX-2細(xì)胞與HBV病毒共培養(yǎng)，24h后更換正常培養(yǎng)液。在其后0h、12h、24h分別收集細(xì)胞并裂解，ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)HBs抗原、HBe抗原。在其后24h，免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBc抗原，HBV DNA定量檢測細(xì)胞內(nèi)HBV DNA。結(jié)果:在HBV共培養(yǎng)

4、LX-2細(xì)胞中檢測到HBs抗原、HBe抗原、HBc抗原的表達(dá)及HBV DNA的存在。這些結(jié)果說明HBV可以感染進(jìn)入LX-2細(xì)胞。
　　HBV對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響。肝纖維化的主要特征是以Ⅰ型膠原蛋白為主的ECM成分過度沉積，本部分以Ⅰ型膠原α1鏈為靶標(biāo)研究HBV致肝纖維化作用。將HBV真核表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，Western Blot檢測Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果:HBV表達(dá)組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯高

5、于對照組。這說明在LX-2細(xì)胞中，HBV可以促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。
　　2.HBV編碼蛋白對LX-2細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響
　　HBV編碼蛋白對COL1A1表達(dá)的影響。上述研究中HBV可以促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白α1鏈表達(dá)，為了探索其分子機(jī)制，首先要確定HBV促進(jìn)Ⅰ型膠原α1鏈表達(dá)的病毒成分。將HBV各編碼蛋白真核表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞。real-time PCR定量檢測COL1A1 mRNA相對

6、表達(dá)，Western Blot檢測Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果表明HBV各編碼蛋白不同程度地促進(jìn)COL1A1mRNA和蛋白表達(dá)，其中HBx的作用最強(qiáng)。
　　HBV編碼蛋白對COL1A1啟動子活性的影響。前述HBV各編碼蛋白均可從轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)COL1A1表達(dá)，推測其可能通過上調(diào)COL1A1啟動子活性促進(jìn)COL1A1轉(zhuǎn)錄表達(dá)。將HBV各編碼蛋白真核表達(dá)載體和空載體分別與COL1A1啟動子報告基因載體及內(nèi)參報告基因載體共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，24

7、h后收集細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子活性。結(jié)果證實HBV各編碼蛋白不同程度地上調(diào)COL1A1啟動子活性，其中HBx的作用最強(qiáng)。
　　3.HBx對LX-2細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究
　　HBV感染LX-2細(xì)胞后HBx在細(xì)胞中的表達(dá)。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBx蛋白可以上調(diào)LX-2細(xì)胞COL1A1啟動子活性進(jìn)而促進(jìn)COL1A1表達(dá)，且作用強(qiáng)于其它的HBV編碼蛋白，以往研究尚無相關(guān)結(jié)果的報道，因此選擇HBx進(jìn)行深入研究。在

8、研究HBx調(diào)控Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的機(jī)制之前，需要明確HBV感染LX-2細(xì)胞后HBx能否在細(xì)胞中表達(dá)。將LX-2細(xì)胞與不同濃度的HBV病毒共培養(yǎng)，48h后去除培養(yǎng)上清，收集并洗滌細(xì)胞后裂解，RT-PCR半定量檢測HBx mRNA表達(dá)，Western Blot檢測HBx蛋白表達(dá)。結(jié)果:隨著共培養(yǎng)的HBV濃度升高，HBx mRNA及蛋白表達(dá)增加。這說明HBV感染LX-2細(xì)胞后HBx蛋白可以在細(xì)胞中表達(dá)，且其表達(dá)量與HBV濃度正相關(guān)。
　　

9、COL1A1啟動子上受HBx調(diào)控的活性區(qū)域。將COL1A1啟動子全長分成兩段:F1段（-2483～-269bp）和F2段(-268～+42bp)，分別構(gòu)建報告基因載體。將構(gòu)建的含COL1A1啟動子各段及全長報告基因載體分別與內(nèi)參報告基因載體組合共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子各段及全長活性。結(jié)果:F2段活性大于F1段活性。將HBx真核表達(dá)載體和空載體分別與COL1A1啟動子F2段及全長報告基因載體組合轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞

10、，雙報告基因檢測COL1A1啟動子F2段及全長活性。結(jié)果:HBx除了促進(jìn)全長啟動子活性，也可以促進(jìn)COL1A1啟動子F2段活性。以上結(jié)果說明: COL1A1啟動子F2段(-268～+42bp)是受HBx調(diào)控的活性區(qū)域，這為進(jìn)一步研究其調(diào)控通路提供了依據(jù)。
　　HBx調(diào)控COL1A1表達(dá)過程中TGFβ1的作用。TGF B1在HSC的活化及COL1A1表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。為了研究TGFβ1是否在HBx調(diào)控COL1A1表達(dá)過程中起作

11、用，使用定量PCR檢測HBx是否促進(jìn)TGFβ1的表達(dá)，雙報告基因法檢測抑制TGFβ1的表達(dá)是否影響HBx對COL1A1啟動子活性的上調(diào)作用。結(jié)果:HBx不促進(jìn)TGFβ1的表達(dá);抑制TGFβ1的表達(dá)不影響HBx對COL1A1啟動子活性的上調(diào)作用。這說明TGFβ1不參與HBx對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的調(diào)控。賈繼東等研究結(jié)果:用TGFβ1中和抗體阻斷TGFβ1與受體的結(jié)合不影響HBV對LX-2細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。這與本研究的結(jié)果一致。<

12、br>　　HBx調(diào)控COL1A1表達(dá)過程中P38 MAPK通路的作用。P38 MAPK通路在HBV誘導(dǎo)的COL1A1表達(dá)過程中發(fā)揮作用。為了研究HBx對COL1A1啟動子的上調(diào)作用是否通過P38 MAPK通路實現(xiàn)，將HBx真核表達(dá)載體和空載體分別與COL1A1啟動子報告基因載體及內(nèi)參報告基因載體共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，6h后，加P38 MAPK通路阻斷劑SB203580，24h后收集細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子活性。結(jié)果:阻斷P3

13、8MAPK通路后，HBx對COL1A1啟動子活性的上調(diào)作用被抑制。這說明P38 MAPK通路參與HBx對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　二、新型抗纖維化藥物篩選模型研究
　　肝纖維化的主要特征是以Ⅰ型膠原蛋白為主的ECM成分過度沉積，故抑制Ⅰ型膠原表達(dá)是目前抗肝纖維化治療的重要策略之一。轉(zhuǎn)錄水平基因啟動子活性的調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，本課題第一部分的研究結(jié)果也能很好的說明這一點，即COL1A1 mRNA及蛋白表達(dá)與C

14、OL1A1啟動子活性具有很好的對應(yīng)關(guān)系。本研究第二部分?jǐn)M以COL1A1啟動子報告基因系統(tǒng)為基礎(chǔ)建立抑制Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抗纖維化藥物篩選和評價模型。
　　1.抗纖維化藥物篩選模型的建立
　　COL1A1啟動子報告基因載體的構(gòu)建。根據(jù)COL1A1基因上游的序列設(shè)計合成擴(kuò)增引物，以人基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增COL1A1啟動子序列，將其插入報告基因載體pGL4中，構(gòu)建COL1A1啟動子報告基因載體pGL4-COL1A1pro

15、moter，限制性酶切和DNA測序鑒定其正確性。
　　抗纖維化藥物篩選模型的建立及檢測。以LX-2細(xì)胞為宿主細(xì)胞，將COL1A1啟動子報告基因載體與內(nèi)參報告基因載體共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子活性?？估w維化藥物篩選模型建立之后，使用對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)有抑制作用的TGFβ1 siRNA驗證其有效性。結(jié)果:TGFβ1siRNA不影響COL1A1啟動子活性。分析其原因:一方面可能與細(xì)胞內(nèi)源性TG

16、Fβ1表達(dá)低下有關(guān);另一方面與正常LX-2細(xì)胞COL1A1啟動子處于低活化狀態(tài)有關(guān)。擬外源表達(dá)活化劑TGF B1活化LX-2細(xì)胞，模擬肝纖維化肝星狀細(xì)胞的高活化狀態(tài)，再進(jìn)行藥物評價實驗。
　　2.抗纖維化藥物篩選模型的優(yōu)化
　　抗纖維化藥物篩選模型的首次優(yōu)化。以HepG2細(xì)胞提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增TGFβ1全長編碼基因，插入到表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建TGFβ1的重組載體pcDNA3.1-TGFβ1

17、，限制性酶切和DNA測序鑒定為正確連接的克隆。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-TGFβ1分別與COL1A1啟動子報告基因載體及內(nèi)參報告基因載體共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子活性。結(jié)果:過表達(dá)TGFβ1僅使COL1A1啟動子活性提高了不到2倍(t=3.396，P=0.0274)。推測其原因:可能是TGFβ1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)但沒有分泌到細(xì)胞外，無法與細(xì)胞膜受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮作用。擬構(gòu)建含分泌信號肽的T

18、GFβ1重組表達(dá)載體，驗證上述推測是否正確。
　　抗纖維化藥物篩選模型的再次優(yōu)化。同上方法構(gòu)建含分泌信號肽的TGFβ1重組表達(dá)載體pJW4303-TGFβ1。將pJW4303、pJW4303-TGFβ1分別與COL1A1啟動子報告基因載體及內(nèi)參報告基因載體共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，雙報告基因檢測COL1A1啟動子活性。結(jié)果:分泌表達(dá)TGFβ1使COL1A1啟動子活性提高了200倍以上(t=21.78，P=0.0001)

19、。該結(jié)果驗證了上述推測:TGFβ1只有被分泌到細(xì)胞外并與自身細(xì)胞膜受體結(jié)合后才能發(fā)揮活化作用。故選擇pJW4303-TGFβ1用于抗纖維化藥物篩選模型的優(yōu)化。
　　3.抗纖維化藥物篩選模型的有效性鑒定
　　文獻(xiàn)報道糖皮質(zhì)激素類藥物地塞米松可以下調(diào)COL1A1啟動子活性進(jìn)而抑制Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，故選其作為陽性模式藥物來鑒定該篩選模型的有效性。在高活化狀態(tài)的篩選模型中，加入不同濃度地塞米松，觀察其抑制效果。結(jié)果:地塞米松對COL

20、1A1啟動子活性具有明顯的抑制作用且具有劑量依賴關(guān)系。這說明該模型可以用于篩選和評價抑制Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抗纖維化藥物。
　　本研究證實了HBV能感染LX-2細(xì)胞并促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá);HBV編碼蛋白尤其是HBx能上調(diào)COL1A1啟動子活性進(jìn)而促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá);TGFβ1不參與而P38 MAPK通路參與HBx對Ⅰ型膠原蛋白的調(diào)控。另外，本研究以COL1A1啟動子活性調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)，建立了一種新型抗纖維化藥物篩選模型，為抑制CO