1、急性排斥反應是導致臨床同種移植術(shù)失敗的主要原因。一般認為，T細胞應答及其效應是介導急性排斥反應發(fā)生的主要機制。 已證實：T細胞激活有賴于雙信號，即TCR特異性識別抗原提呈細胞(APC)所提呈抗原肽而產(chǎn)生的第一信號，以及APC與T細胞表面共刺激分子相互作用所提供的第二信號。 同種器官移植中，由于外科手術(shù)、缺血/缺氧和缺血再灌注等因素，使受者體內(nèi)出現(xiàn)細胞應激和炎性“瀑布式”反應，可產(chǎn)生多種內(nèi)源性危險信號，從而激活APC并誘導

2、同種反應性T細胞活化。因此，阻斷內(nèi)源性危險信號乃抑制移植排斥反應的重要策略。 高遷移率族蛋白B1(HMGB1，highmobilitygroupbox1)是一種核內(nèi)蛋白，在30余年前已被發(fā)現(xiàn)。其組成性表達于各種組織細胞的胞核內(nèi)，具有多種重要的核內(nèi)功能。近年發(fā)現(xiàn)，HMGB1也可出現(xiàn)于胞外，其來源為：由壞死細胞(而非凋亡細胞)被動釋放，或由受刺激的單核/巨噬細胞主動分泌。釋放至胞外的HMGB1可與多種免疫細胞相互作用，直接介導非特異

3、性炎癥反應，也可作為內(nèi)源性危險信號激活APC[主要是樹突狀細胞(DC)]，從而啟動、增強特異性免疫應答，并參與多種疾病過程發(fā)生和發(fā)展。 實驗研究中，阻斷胞外HMGB1的活性，已成為干預相關(guān)疾病過程的重要策略。HMGB1的截短形式A盒蛋白和抗HMGB1中和抗體均為HMGB1拮抗物，可特異性逆轉(zhuǎn)HMGB1的胞外活性。使用該兩種拮抗物，可緩解實驗性關(guān)節(jié)炎及膿毒血癥病情，提高實驗動物存活率。 本課題通過建立小鼠同種腹部異位心臟移

4、植模型，觀察急性移植排斥反應中移植物HMGB1表達，探討HMGB1與急性排斥反應的相關(guān)性；在此基礎上，制備并應用HMGB1的特異性拮抗物GST-Abox重組蛋白，觀察對移植物存活時間的影響，并初步探討其機制。 一、HMGB1表達與同種急性排斥反應相關(guān)性 實驗分組為：①異基因心臟移植組，供者為BALB/C近交系小鼠，受者為C57BL/6近交系小鼠；②同基因心臟移植組，供者為和受者均為C57BL/6近交系小鼠。 前期

5、實驗證明：異基因心臟移植組移植物平均存活時間為7.67±1.03天，同基因心臟移植組未出現(xiàn)排斥反應。在移植后1d、3d、7d觀察如下指標：移植心臟中炎性細胞浸潤、移植心臟HMGB1mRNA表達水平、移植心臟炎性細胞因子mRNA表達水平。結(jié)果如下： 1.術(shù)后1d，同種移植心臟HMGB1和TNF-α的mRNA表達即升高，但與同系對照表達相當，兩組中IFN-γ表達均未上調(diào)； 2.術(shù)后3d，HMGB1和TNF-α表達持續(xù)上升，術(shù)

6、后7天表達量達高峰，與同系對照相比，差異有顯著性(P＜0.05)； 3.術(shù)后7d，同種移植心臟IFN-γ的mRNA表達上調(diào)，與同系對照相比，差異有顯著性(P＜0.05)； 以上結(jié)果表明：HMGB1可能是一種排斥反應相關(guān)因子，其不僅與TNF-α共同參與移植術(shù)后早期發(fā)生的非特異性炎癥應答，且可能與其后的急性排斥反應(即同種抗原特異性應答)有關(guān)。 二、HMGB1特異性拮抗物GST-Abox的制備、純化和功能鑒定

7、 成功構(gòu)建PGEX-4T-2-Abox原核表達載體，并通過原核表達獲得大量GST-Abox重組蛋白；借助親和純化及去內(nèi)毒素處理，重組蛋白純度和特異性大大增強；生物學實驗證實，GST-Abox可有效拮抗HMGB1的生物學功能。 三、應用HMGB1特異性拮抗物可延長移植心臟存活時間 借助腹腔注射，術(shù)前1d至術(shù)后4d每天向受者體內(nèi)輸入100μl(1mg)GST-Abox重組蛋白，以干預同種排斥反應，并設立GST對照組和空白對照

8、組，于術(shù)后7d及/或移植心臟停跳時檢測如下指標： 1.GST-A盒重組蛋白對異基因移植心臟存活時間的影響 應用GST-A盒重組蛋白能明顯延長移植心臟存活時間，實驗組平均存活時間為12.5±1.87天，與陰性對照組(6.5±1.04天)和空白對照組(7.67±1.03天)相比有顯著性差異(p＜0.05)。 2.移植心臟HE染色 與對照組相比，GST-Abox處理組心肌細胞間淋巴細胞浸潤明顯減少，未出現(xiàn)毛細血

9、管淤血、間質(zhì)出血、動脈炎和靜脈炎等現(xiàn)象。 3.GST-A盒重組蛋白對受者小鼠脾臟DC共刺激分子表達的影響 借助流式細胞術(shù)分別檢測移植后6天各組受者小鼠脾臟DC共刺激分子CD80、CD86表達，結(jié)果表明： *與GST組對照組(MFI=149.97)和NS對照組(MFI=122.92)相比，GST-Abox處理組脾臟DC表達CDS0明顯下調(diào)(MFI=44.94)，差異有顯著性(p＜0.05)； *與GST組對

10、照組(MFI=305.62)和NS對照組(MFI=274.15)相比，GST-Abox處理組脾臟DC表達CD86下調(diào)(MFI=242.83)，但差異無顯著性(p＞0.05)。 4.GST-A盒重組蛋白對受者小鼠脾臟IFN-γ分泌細胞數(shù)量的影響 借助細胞內(nèi)流式細胞術(shù)分別檢測移植后7天各組受者小鼠脾臟IFN-γ分泌細胞的數(shù)量，結(jié)果如下： *GST-Abox處理組、GST對照組和生理鹽水對照組Th1細胞(CD4+IFN

11、-γ+)分別為11.35％、17.35％和12.41％，差異不明顯； *GST-Abox處理組Tc1細胞(CD8+IFN-γ+)為22.96％，明顯少于GST組對照組(33.23％)和生理鹽水對照組(35.57％)。 5.移植心臟HMGB1和細胞因子mRNA表達 術(shù)后1d、3d、7d分別采取各組移植心臟組織，提取總RNA，借助實時定量RT-PCR技術(shù)檢測HMGB1、TNF-α、和IFN-γ的mRNA表達水平，結(jié)果

12、如下： *GST組和NS組各時段HMGB1、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平相近，差異無顯著性； *與上述兩組相比，術(shù)后3d和7dGST-Abox處理組HMGB1及TNF-α的mRNA表達水平明顯降低，差異有顯著性(p＜0.05)； *與上述兩組相比，術(shù)后7dGST-Abox處理組IFN-γ的mRNA表達水平明顯降低，差異有顯著性(p＜0.05)。 以上結(jié)果表明：GST-Abox重組蛋白具有抗排斥

13、效應，其抗排斥反應的機制與下調(diào)受者脾臟DC共刺激分子表達、阻抑Tc1細胞極化及下調(diào)移植物HMGB1和炎癥性細胞因子表達有關(guān)。 四、GST-Abox延長移植物存活的機制 1.GST-Abox重組蛋白對LPS刺激所致DC成熟的影響 用GST-Abox重組蛋白與LPS、未成熟DC共孵育24h后檢測DC表型，結(jié)果表明：應用GST-Abox重組蛋白后，表達MHCⅡ類分子、CD80和CD86陽性的DC細胞數(shù)分別為27.16％

14、、41.19％和47.05％，與LPS刺激組相比有顯著性差異(p＜0.01)，表明GST-Abox重組蛋白可拮抗LPS誘導的DC成熟。 2.LPS可刺激DC主動分泌HMGB1 *用1μg/mlLPS刺激未成熟DC(C57BL/6小鼠骨髓來源)24hr，借助免疫細胞化學技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測HMGB1在DC細胞中的亞細胞定位，結(jié)果表明：LPS刺激后，HMGB1在DC細胞中定位發(fā)生變化，由胞核向胞漿遷移； *在刺

15、激前(Ohr)、刺激后8、16、24hr分別取細胞上清和刺激前后的細胞沉淀，進行Western-blot檢測，結(jié)果表明：刺激前后DC細胞總HMGB1水平無差別，刺激后8hr細胞上清中即可檢出HMGB1，且呈時間依賴性逐漸增加，至24hr達到高峰。以上結(jié)果表明：LPS可刺激DC主動分泌HMGB1。 3.GST-Abox重組蛋白可抑制單向混合淋巴細胞反應 用未成熟DC與LPS、GST-Abox重組蛋白預孵育8hr后，與同種T

16、細胞進行混合淋巴細胞培養(yǎng)，3H-TdR摻入法檢測T細胞增殖，結(jié)果表明：LPS刺激后的DC細胞可明顯促進異基因T淋巴細胞增殖；GST對該效應無影響；而GST-Abox重組蛋白則可拈抗此效應。 以上結(jié)果提示：非成熟DC轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C過程中，能自分泌HMGB1，后者對DC進一步成熟具有重要意義；GST-Abox延長移植心臟存活的機制之一可能與阻抑DC表型和功能成熟有關(guān)。 結(jié)論 1.HMGB1與急性排斥反應的發(fā)生相關(guān)，其