1、金黃色葡萄球菌(Saphylococcusaureus)是人類和某些動物的病原菌之一，其致病力強(qiáng)弱主要取決于產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶的能力，其中金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素，是引起人類食物中毒和葡萄球菌胃腸炎的主要原因，因此，這方面的研究已成為科學(xué)家們普遍關(guān)注的重要課題。本文以主要產(chǎn)B型腸毒素的金黃色葡萄球菌S6菌株為研究對象，采用X-射線衍射、掃描電鏡、原子力顯微鏡、分子振動光譜(紅外、激光拉曼)、圓二色譜、熒光光譜等現(xiàn)代分析技術(shù)表征金黃色

2、葡萄球菌B型腸毒素(staphylococcalenterotoxinB，簡稱SEB)的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)、三維立體形貌、分子鏈構(gòu)象及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成。同時(shí)著重研究了腸毒素在稀溶液狀態(tài)和外界環(huán)境改變時(shí)的構(gòu)象特征及可能的去折疊過程，嘗試用蛋白質(zhì)構(gòu)象理論揭示腸毒素耐熱的根本原因，尋找其耐熱的可能優(yōu)勢構(gòu)象，建立研究蛋白質(zhì)構(gòu)象與生物學(xué)活性相關(guān)性的新方法。此外，還從酸奶發(fā)酵菌株和金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)特性出發(fā)，研究了乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的

3、抑制作用及其在抑制過程中熱效應(yīng)的微量變化，從熱化學(xué)的角度探討其作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下： 1.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的分離純化采用玻璃紙覆蓋瓊脂平板法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，首先利用羧甲基纖維素陽離子CM-32柱層析，對B型腸毒素進(jìn)行初步分離富集，然后依據(jù)篩分原理按分子量大小經(jīng)SephadexG-75凝膠進(jìn)一步純化，得到電泳純B型腸毒素，得率為26.8％，紫外吸收光譜測得其特征吸收峰為276.6nm，SDS-PAGE凝膠電泳分析

4、其相對分子質(zhì)量為2.8×104，與文獻(xiàn)報(bào)道值一致。 2.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的結(jié)構(gòu)表征利用X-射線衍射、掃描電鏡、原子力顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、激光拉曼光譜等現(xiàn)代分析手段對金黃色葡萄球菌B型腸毒素的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)、分子鏈形態(tài)，二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，SEB為一種單純蛋白，其聚集態(tài)包含結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，結(jié)晶度為37.8％，其分子聚集在一起，形態(tài)主要為片狀和平板狀，具有一定的規(guī)整性。原子力顯微鏡首次觀察到SEB在稀溶液狀

5、態(tài)下的單分子鏈長度約為1500nm，分子鏈寬度約為20～40nm，分子鏈高0.6nm。SEB的傅里葉變換紅外光譜和激光拉曼光譜分析表明，SEB的二級結(jié)構(gòu)單元主要為B-折疊和α-螺旋，無規(guī)卷曲含量較少，側(cè)鏈C-C-S-S-C-C構(gòu)型為反式－扭曲－反式。 3.金黃色葡萄球菌B型腸毒素的稀溶液構(gòu)象及去折疊作用研究大分子的溶液構(gòu)象和蛋白質(zhì)的去折疊作用是近來揭示蛋白質(zhì)生物活性及其與高級結(jié)構(gòu)相關(guān)性的重要切入點(diǎn)。金黃色葡萄球菌B型腸毒素水溶液

6、(濃度為0.02mol/L)在25℃的遠(yuǎn)紫外CD譜顯示，其二級結(jié)構(gòu)各構(gòu)象單元含量分別為：α-螺旋22.6％、β-折疊40.4％、轉(zhuǎn)角19.2％和無規(guī)卷曲17.7％，說明SEB屬于β-折疊含量較高的蛋白質(zhì)。在50～121℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，SEB二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量逐漸下降，從25℃時(shí)的22.6％降為95℃的9.6％，在121℃時(shí)，α-螺旋完全消失。同SEB二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋變化相反，β-折疊含量則相對保持穩(wěn)定，僅在75℃時(shí)

7、其含量為8.5％，而在其它溫度處理下，含量均在30.2％以上，121℃時(shí)仍保持39.9％，溫度變化(除了75℃外)幾乎不能引起SEB去折疊，由此說明β-折疊是保持SEB二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的優(yōu)勢構(gòu)象單元。SEB經(jīng)121℃處理后的激光拉曼光譜顯示，表征其二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋和二硫鍵譜帶消失，而在1672cm-1處仍保持β-折疊的特征譜帶，同樣證實(shí)SEB是一種熱穩(wěn)定性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，從分子水平探討了腸毒素?zé)岱€(wěn)定性的機(jī)理，這一結(jié)論未見文獻(xiàn)報(bào)道。

8、本實(shí)驗(yàn)通過CD和熒光光譜分析研究了SDS、脲和乳酸鏈球菌素對稀溶液中SEB構(gòu)象的影響。實(shí)驗(yàn)表明，SDS和乳酸鏈球菌素均能使SEB構(gòu)象單元中的α-螺旋含量下降，B-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，但仍然保持β-折疊的主導(dǎo)結(jié)構(gòu)，說明SDS和乳酸鏈球菌素對SEB不具有減毒或滅活作用。脲的作用相反，它能使SEB二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋構(gòu)象單元的含量顯著增加，而β-折疊和無規(guī)則卷曲消失，轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，起到去折疊的作用，從而證實(shí)了脲處理并不能使變性的腸毒素

9、恢復(fù)活性而有利于檢測這一推測。 熒光光譜研究表明，在不同濃度脲的作用下(脲濃度依次為0、0.1、1、2、3、4、5、6mol/L)，隨著脲濃度的增加，SEB分子中的Trp進(jìn)入疏水環(huán)境，熒光量子產(chǎn)率降低，熒光強(qiáng)度減弱；而在不同濃度SDS和乳酸鏈球菌素作用下，隨著SDS和乳酸鏈球菌數(shù)濃度的增加，SEB分子中的Trp進(jìn)入親水環(huán)境，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。30％乙醇和30％甘油分別使SEB內(nèi)源熒光強(qiáng)度增強(qiáng)29.9％和461.0％，最大發(fā)射波長保持

10、不變，其作用效果和SDS一致。SEB對Nisin熒光光譜影響不大，Nisin熒光光譜的最大發(fā)射峰位置基本沒有發(fā)生變化，相對熒光強(qiáng)度僅有微弱的增強(qiáng)，說明SEB與Nisin相互作用時(shí)，僅有較小的能量轉(zhuǎn)移。 4.金黃色葡萄球菌B型腸毒素抗體的制備及間接競爭ELISA檢測方法的建立以Balb/c小鼠為免疫對象，采用小劑量長周期免疫方案，多點(diǎn)多次注射金黃色葡萄球菌B型腸毒素，待小鼠血清效價(jià)達(dá)到要求后，腹腔注射P2/0骨髓瘤細(xì)胞抽取腹水制備

11、抗體，間接ELISA測定抗體效價(jià)可達(dá)1：105左右，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 以自制抗原和抗體建立的金黃色葡萄球菌B型腸毒素間接競爭ELISA方法的最低檢測量為1ng/mL，線性檢測范圍為1～103ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951，對人工污染樣品的平均回收率為94.5％。 5.乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制作用的研究乳酸菌及代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制作用研究表明，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí)

12、，由于環(huán)境pH值的降低、抗微生物因子的存在及微生物之間的營養(yǎng)競爭作用，使得金黃色葡萄球菌的生長受到了抑制。乳酸、乙酸和過氧化氫均對金黃色葡萄球菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著含量的增加，抑制作用增強(qiáng)。乳酸和乙酸對金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于無機(jī)酸(鹽酸)，pH3.5時(shí)，三種酸均可顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長。乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑制作用與濃度呈正相關(guān)，y=0.8025x+5.12，R2=0.9939。 6.乳酸鏈球菌素

13、對金黃色葡萄球菌抑制作用的微量熱學(xué)研究首次采用微量熱法研究乳酸鏈球菌素(Nisin)對金黃色葡萄球菌的抑制作用。在Nisin作用下，金黃色葡萄球菌的生理、生化和代謝特征均發(fā)生了變化。結(jié)果表明，隨著Nisin濃度的增加，金黃色葡萄球菌的生長速率常數(shù)降低、傳代時(shí)間延長，且Nisin濃度越高，其作用越明顯。金黃色葡萄球菌的生長速率常數(shù)(k)和Nisin的濃度(c)之間的關(guān)系式為k=0.0377-3.988×10-4c，R=-0.9971，Ni

14、sin對金黃色葡萄球菌的半數(shù)抑制濃度為48.05IU/mL，金黃色葡萄球菌的臨界生長濃度值為94.53IU/mL。微量熱法所反映的生長速率常數(shù)、傳代時(shí)間、半數(shù)抑制濃度和臨界生長濃度值均可作為評價(jià)Nisin抑菌作用的一個(gè)定量指標(biāo)，同樣可用于評價(jià)其它細(xì)菌素對微生物的生物活性作用。此方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 7.金黃色葡萄球菌在酸奶中生態(tài)學(xué)初步研究金黃色葡萄球菌在酸奶中的初步生態(tài)學(xué)研究表明，原料乳中金黃色葡萄球菌初始接種量對其生存能

15、力有決定性的影響。原料乳中金黃色葡萄球菌初始接種量分別為1.8×10、1.8×102cfu/mL時(shí)，在酸奶發(fā)酵與冷藏過程中均未檢測出金黃色葡萄球菌，且成品酸奶中金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶、腸毒素的檢測均為陰性；原料乳中金黃色葡萄球菌的接種量分別為8.5×103、2.7×104、2.7×105、1.8×106cfu/mL時(shí)，在酸奶發(fā)酵過程中，金黃色葡萄球菌菌數(shù)呈明顯上升趨勢；而冷藏過程中，金黃色葡萄球菌菌數(shù)呈逐漸下降趨勢，成品酸奶中耐熱核酸