1、目的:食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國是食管癌高發(fā)區(qū)。食管癌早期缺乏特異臨床表現(xiàn)，大部分食管癌患者就診時已經(jīng)屬于晚期，近年來雖然手術(shù)及放射、化學(xué)療法在食管癌治療方面取得了一定的進(jìn)步，但是5年總體生存率仍然低于20％。食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移是影響患者療效和預(yù)后的重要因素，也是當(dāng)前食管癌研究中最重要的一個方面。蛋白酶激活受體-2(Proteinase-actived receptors2，PAR-2)屬于細(xì)胞膜表面受體，是與G蛋白相耦

2、聯(lián)的蛋白酶激活受體超家族成員，胰蛋白酶、類胰蛋白酶、凝血因子等是該受體的天然激動劑，PAR-2受激活后可引起一系列關(guān)于腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖生長等方面的生物學(xué)行為。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞EC109表達(dá)PAR-2，PAR-2激活后可使基質(zhì)金屬蛋白酶分泌增加，從而促進(jìn)EC109細(xì)胞的運動、侵襲能力。RNA干擾(RNAi)是由小分子干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，siRNA通過與靶mRNA特異性互補(bǔ)配對，引起靶mRN

3、A降解或抑制其翻譯，從而使靶基因表達(dá)抑制。RNA干擾因其對靶基因的沉默具有高度的特異性和強(qiáng)大的抑制作用，正越來越多地應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防和治療研究。本實驗通過PAR-2基因靶向shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌EC109細(xì)胞，建立PAR-2基因沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株，進(jìn)而來研究PAR-2基因沉默對食管癌EC109細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力的影響。
　　 方法:針對人PAR-2的mRNA序列，設(shè)計并體外合成編碼shRNA的兩條特異性寡核苷酸序列，

4、分別插入pGFP-V-RS質(zhì)粒載體中構(gòu)建兩個shRNA表達(dá)質(zhì)粒(PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2)，經(jīng)過鑒定，然后將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞EC109中，經(jīng)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株，運用RT-PCR和Western Blot法檢測PAR-2的表達(dá)，從而篩選出最佳干擾序列的穩(wěn)定細(xì)胞株P(guān)AR-2 shRNA EC109;運用MTT及流式細(xì)胞術(shù)法檢測PAR-2 shRNA EC109細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的變化

5、;Transwell小室法檢測PAR-2基因沉默前后細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建PAR-2基因靶向shRNA表達(dá)質(zhì)粒并測序鑒定成功構(gòu)建了PAR-2基因靶向shRNA表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)粒PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2與設(shè)計的靶向PAR-2的寡核苷酸序列比較完全一致。
　　 2.通過RNAi技術(shù)成功篩選出了PAR-2基因表達(dá)下調(diào)的食管癌PAR-2s

6、hRNA EC109穩(wěn)定細(xì)胞株
　　 2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果顯示PAR-2 shRNA-1組、PAR-2shRNA-2組、非特異性序列轉(zhuǎn)染組和空白對照組，四組吸光度的比值分別為0.35±0.03、0.43±0.04、0.44±0.04、0.45±0.41。PAR-2 shRNA-1組PAR-2mRNA相對表達(dá)顯著降低，與另外三組比較差異有顯著意義(P＜0.05)。PAR-2 shRNA-2組、非特異

7、性序列轉(zhuǎn)染組和空白對照組三組間PAR-2mRNA相對表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞的Western-Blot結(jié)果顯示四組灰度比值分別為0.96±0.01、1.04±0.02、1.05±0.04、1.09±0.04。PAR-2 shRNA-1組PAR-2蛋白的表達(dá)明顯減少，與另外三組相比差異有顯著意義(P＜0.05)。而PAR-2shRNA-2組、非特異性序列轉(zhuǎn)染組和空白對照組三組間P

8、AR-2蛋白表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 3.MTT法檢測PAR-2shRNAEC109細(xì)胞的增殖活性，顯示PAR-2shRNAEC109細(xì)胞增殖低于正常對照組，24、48、72小時的細(xì)胞抑制率分別為:15.92％、24.89％、32.28％，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染試劑組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與正常對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測PAR-2shRNAEC

9、109細(xì)胞周期變化，顯示PAR-2shRNAEC109細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，轉(zhuǎn)染24、48、72小時S期細(xì)胞比例分別為(32.79±4.06)％、(26.54±1.37)％和(33.45±2.46)％，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 5.Transwell小室法檢測PAR-2基因沉默前后細(xì)胞侵襲和遷移能力
　　 5.1 在侵襲實驗中，PAR-2 shRNA EC109細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)為19.6±2

10、.11(200×)，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 5.2 在遷移實驗中，PAR-2 shRNA EC109細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)為24.2±2.82(200×)，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論;
　　 1.成功構(gòu)建靶向PAR-2基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞EC109，能有效抑制該細(xì)胞株P(guān)AR-2mRNA和蛋白的表達(dá);成功獲得PAR-2基因下調(diào)的人食管癌穩(wěn)