1、小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘發(fā)的神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元損傷在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)等神經(jīng)退行性疾病病理生理機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。過(guò)渡金屬離子,特別是具有氧化還原活性的Cu2+,對(duì)于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理生化功能起著重要的作用。腦內(nèi)Cu2+濃度過(guò)高或過(guò)低均可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。有證據(jù)顯示,神經(jīng)退行性疾病患

2、者或者動(dòng)物模型腦內(nèi)細(xì)胞內(nèi)外Cu2+分布不平衡,細(xì)胞外Cu2+濃度升高,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出正常生理濃度,而細(xì)胞內(nèi)Cu2+濃度降低;過(guò)高濃度的細(xì)胞外Cu2+可直接損傷神經(jīng)元,但是否能夠直接激活與神經(jīng)元密切接觸的小膠質(zhì)細(xì)胞,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?本課題擬對(duì)Cu2+直接作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后,其功能狀態(tài)的改變及其分子機(jī)制進(jìn)行較深入探討。
　　本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞以及小鼠BV-2細(xì)胞株,應(yīng)用ELISA、Greiss法和WST-1試劑測(cè)定小膠

3、質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的腫瘤壞死因子-α( Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide,NO)以及超氧化物(superoxide)含量;應(yīng)用Amplex Red試劑測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清或分離線粒體組織中過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)的含量;應(yīng)用能夠特異性檢測(cè)活細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的熒光探針,檢測(cè)線粒體內(nèi)RO

4、S含量;應(yīng)用Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、IκB-α表達(dá)以及Akt、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2)磷酸化水平。
　　研究結(jié)果顯示:1)Cu2+處理12 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的激活狀態(tài);Cu2+(5-50μM)能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-

5、α和NO,并誘導(dǎo)iNOS表達(dá);2)IκB-α和IKK-2阻斷劑能夠顯著抑制Cu2+誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生;Cu2+作用12h后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)IкB-α表達(dá)明顯下降(為NF-кB激活標(biāo)志之一),提示Cu2+激活小膠質(zhì)細(xì)胞的作用為NF-кB依賴性;3)在激活小膠質(zhì)細(xì)胞劑量下,Cu2+對(duì)原代海馬神經(jīng)元沒有明顯毒性,但其處理小膠質(zhì)細(xì)胞后獲得的條件培養(yǎng)液能夠明顯降低神經(jīng)元活力;4)Cu2+處理后小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中H2O2含量明顯增加(該作用在Cu2

6、+處理后5 min即可產(chǎn)生);煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)阻斷劑Apocynin(100μM)和Diphenyleneidonium(DPI,10μM)預(yù)處理對(duì)該作用沒有明顯影響;Cu2+處理后小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中超氧化物水平?jīng)]有明顯變化;Cu2+能夠促進(jìn)分離的線粒體組織釋放H2O2(該作用同樣在Cu

7、2+處理后5 min即可產(chǎn)生),以及活細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生。提示ROS(以H2O2的形式)可能參與了Cu2+誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用,而且該H2O2的來(lái)源可能為線粒體,而非NOX;5) NOX阻斷劑Apocynin(100μM)和DPI(10μM)預(yù)處理不影響Cu2+誘導(dǎo)的TNF-α釋放,進(jìn)一步提示NOX可能不參與Cu2+激活小膠質(zhì)細(xì)胞作用;6)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)阻斷劑LY2

8、94002(25μM)和ERK1/2阻斷劑U0126(10μM)預(yù)處理能夠顯著抑制Cu2+誘導(dǎo)的TNF-α釋放,而蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻斷劑對(duì)此沒有阻斷作用;Western blot結(jié)果顯示Cu2+作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后,ERK1/2和Akt磷酸化水平明顯升高。提示PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)均參與了Cu2+激活小膠質(zhì)細(xì)胞作用;7)應(yīng)用LY294002預(yù)處理后,再應(yīng)用Cu2+處理小膠質(zhì)細(xì)胞,ERK1/

9、2磷酸化水平不再升高,提示在功能上PI3K/Akt信號(hào)可能位于ERK1/2信號(hào)上游;8)LY294002和U0126均能夠抑制Cu2+誘導(dǎo)的H2O2釋放,提示PI3K/Akt-ERK1/2信號(hào)通路可能介導(dǎo)了H2O2的產(chǎn)生。
　　綜上,本研究通過(guò)一系列細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了:1)亞神經(jīng)毒性劑量下Cu2+能夠直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)NF-кB活化,促進(jìn)TNF-α和NO等炎癥因子的產(chǎn)生,并由此導(dǎo)致間接神經(jīng)元毒性;該作用可能不依賴于NOX。