1、本課題設(shè)計(jì)、合成了5條靶向結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)異檸檬酸裂合酶(isocitratelyase，ICL)mRNA的特異性10-23脫氧核酶(DNAzymeordeoxyribozyme，DRz)，在無(wú)細(xì)胞體系中篩選和鑒定了上述10-23DRzs對(duì)結(jié)核分枝桿菌icimRNA的切割活性，在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)驗(yàn)證了1O-23DRz對(duì)結(jié)核分枝桿菌ICL蛋白表達(dá)及酶活性的影響，并分別研究了10-23

2、DRz對(duì)Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)感染的影響，最后探討了10-23DRz與抗癆藥物異煙肼(isoniazid，INH)聯(lián)合應(yīng)用治療小鼠結(jié)核病的效果。 第一部分 結(jié)核分枝桿菌icl基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及rlCL的純化和多克隆抗體的制備 目的：構(gòu)建Mtbicl基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在E．coli中表達(dá)后純化rlCL，制備抗rICL的多克隆抗體，為后續(xù)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：采用PCR法從Mtb基因組DNA中

3、擴(kuò)增出1c1基因片段，將其插入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-ici。將pQE30-fcl轉(zhuǎn)化大腸桿菌SGl3009后用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，免疫印跡法(Western-blot)鑒定后采用Ni-NTA樹(shù)脂親和純化該表達(dá)產(chǎn)物，鑒定其酶活性并用此純化蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。 結(jié)果：經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和DNA雙向測(cè)序證實(shí)，pQE30-icl原核表達(dá)載體構(gòu)建成功；pQE30-ic]在E．coli中表達(dá)的目的

4、產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析其分子量約為47kDa，免疫印跡分析證實(shí)目的蛋白可與結(jié)核病患者抗血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)。純化的重組ICL蛋白具有異檸檬酸裂解酶的活性。雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)得該重組蛋白免疫新西蘭兔產(chǎn)生的抗體效價(jià)為l：32。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Mtbicj基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)和純化了具有酶活性的rlCL，并獲取了抗rICL的多克隆抗體。 第二部分 MtbiclmRNA特異性10-23DRz的設(shè)計(jì)及其在無(wú)細(xì)胞體系中切割活性

5、的鑒定 目的：設(shè)計(jì)可特異性切割MtbiclmRNA的10-23DRz，在無(wú)細(xì)胞體系中鑒定其切割icfnffiNA的活性，并探討其在不同條件下對(duì)靶mRNA的切割特點(diǎn)。 方法：采用計(jì)算機(jī)軟件模擬ic]mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，據(jù)此選擇適合的待切割靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)針對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的特異性10-23DRz。將icl基因亞克隆至pET32a+中的T7啟動(dòng)子下游，采用T7RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄法制備Mtbicl基因的mRNA。用上述設(shè)計(jì)的10-23

6、DRzs在無(wú)細(xì)胞體系中對(duì)ICLmRNA進(jìn)行切割，切割產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝胺電泳鑒定。選擇上述切割活性最強(qiáng)的DZ4考察不同10-23DRz劑量、不同反應(yīng)時(shí)間、不同鎂離子濃度條件下及不同錯(cuò)配或突變10-23DRz的切割特點(diǎn)。 結(jié)果：根據(jù)高級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖在iclmRNA上選擇了5個(gè)切割靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)了5條針對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的10-23DRz(DZl-DZ5)。pET32-ic．1體外轉(zhuǎn)錄用載體構(gòu)建成功并經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成功獲取了Mtbicl,基因的全

7、長(zhǎng)mRNA。無(wú)細(xì)胞體系的切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DZl、DZ3、DZ4及DZ5可有效地切割ic2mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之間，以DZ4的切割效率最高。對(duì)DZ4切割活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)靶mRNA的切割具有劑量和時(shí)間的依賴(lài)性；當(dāng)Mg2+濃度為2umol／L(相當(dāng)于機(jī)體生理?xiàng)l件下的濃度)時(shí)即可檢測(cè)到DZ4的切割活性，在2-20umol／L范圍內(nèi)，DZ4的切割活性與Mg2+濃度呈正相關(guān)；當(dāng)DZ4單側(cè)底物結(jié)合臂上出現(xiàn)一個(gè)不與靶mRNA配

8、對(duì)的堿基時(shí)其切割效率大大降低，當(dāng)兩側(cè)底物結(jié)合臂上各含一個(gè)不與靶mRNA配對(duì)的堿基或其活性中心域出現(xiàn)一個(gè)堿基突變(第六位：G—C)時(shí)，DZ4完全喪失切割活性。 結(jié)論：10-23DRz可特異、有效地切割Mtb1clmRNA，且在機(jī)體生理狀態(tài)的Mg2+濃度(2umol／L)下即可發(fā)揮切割效果，有望用于抗結(jié)核分枝桿菌的感染。 第三部分 lO-23DRz對(duì)MtbICL表達(dá)及其在巨噬細(xì)胞中存活的影響 目的：探討10-23DR

9、z抑制結(jié)核分枝桿菌ICL的表達(dá)及其對(duì)Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)、外存活能力的影響。 方法：利用DZ4在不同條件(DZ4單獨(dú)作用，與亞抑菌濃度的INH或EMB聯(lián)合作用，在DZ4末端修飾膽固醇分子等)下對(duì)培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中的Mtb進(jìn)行處理，于處理后不同時(shí)間收集細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌后用乙醛酸苯腙生成法檢測(cè)上清液中ICL酶活性變化，間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)ICL的表達(dá)變化。分別取用或不用DZ4處理的Mtb感染巨噬細(xì)胞，于感染后不同

10、時(shí)間采用Ziehl-Heelson抗酸染色法和裂解巨噬細(xì)胞后培養(yǎng)Mtb的方法，觀察10-23DRz對(duì)Mtb感染巨噬細(xì)胞的影響。同時(shí)分別取用或不用DZ4處理的Mtb直接接種于改良羅氏培養(yǎng)基，觀察lO-23DRz對(duì)Mtb在巨噬細(xì)胞外生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果：5μMDZ4與亞抑菌濃度的INH聯(lián)用可顯著抑制MtbICL的表達(dá)，與單用相應(yīng)濃度的INH比較，當(dāng)INH為10ug／L時(shí)，IⅫ+DZ4處理1、2、3周后MtbICL酶活性下降34．9％～

11、46．7％(P<0．01)；當(dāng)INH為5ug／L時(shí)，INH+DZ4處理1、2、3周后MtbICL酶活性下降21．9％36．9％(P<0．01)。Ziehl-Heelson抗酸染色及菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，DZ4與INH聯(lián)合處理后的Mtb在巨噬細(xì)胞THP-1內(nèi)存活的能力顯著下降，在感染后4d和7d時(shí)，THP-1細(xì)胞內(nèi)的荷菌量分別由單用相應(yīng)濃度INH處理對(duì)照組的126．5×104、307．5×104(10ug／LINH)和133．0×104、3

12、25．4×104(5μg／LINH)下降至54．6×104、114．3×104和71．7×104、174．4×104。10-23DRz對(duì)Mtb在M7H10培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 結(jié)論：INH可有效促進(jìn)10-23DRz進(jìn)入Mtb；10-23DRz與亞抑菌濃度的工Ⅻ聯(lián)用可有效抑制MtbICL的表達(dá)，降低其在巨噬細(xì)胞中的存活能力，但對(duì)Mtb在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 第四部分 lO-23DRz對(duì)舭b感染小鼠的影響

13、 目的：探討ic2mRNA特異性10-23DRz對(duì)Mtb在小鼠體內(nèi)感染能力的影響。 方法：分別取用或不用iclmRNA特異性10-23DRz預(yù)處理的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，經(jīng)小鼠尾靜脈感染BALB／C小鼠，分別于感染后的2、4、8、12w時(shí)處死各組小鼠，進(jìn)行肺、脾組織的抗酸染色和菌落計(jì)數(shù)，并于感染后4w和12w時(shí)觀察各組小鼠肺、脾的病理變化。 結(jié)果：菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染小鼠2周時(shí)，各組結(jié)核桿菌在小鼠體內(nèi)的

14、感染能力無(wú)顯著差別，感染4w后，INH與DZ4聯(lián)合處理后的結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的感染能力顯著下降(P

15、療小鼠結(jié)核病的研究 目的：探討10-23DRz與異煙肼聯(lián)合應(yīng)用治療小鼠結(jié)核病的效果。 方法：首先用FITC標(biāo)記的10-23DRz對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻，于滴鼻后不同時(shí)間進(jìn)行肺組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察熒光情況，探討10-23DRz滴鼻給藥的可行性。然后通過(guò)尾靜脈注射方法建立BALB／c小鼠結(jié)核病感染模型。感染小鼠進(jìn)行如下分組處理：不治療對(duì)照組；單純INH治療；單純10一23DRz治療；INH+i0—23DRz聯(lián)合治療、INH

16、與對(duì)照寡脫氧核苷酸(DZ4一S)聯(lián)合治療。于初次治療6W后處死小鼠，進(jìn)行肺、脾組織抗酸染色和Mtb的培養(yǎng)，觀察小鼠肺組織的病理改變。 結(jié)果：經(jīng)滴鼻途徑可有效將脫氧核酶遞送至小鼠肺部。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及病理檢測(cè)結(jié)果顯示，10-23DRz治療組與未治療對(duì)照組間的結(jié)果無(wú)顯著差異，INH+10—23DRz治療組、INH+DZ4一S治療組與INH治療組間結(jié)果無(wú)顯著差異。 結(jié)論：按如上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，未能觀察到10—23DRz對(duì)小鼠結(jié)核病有治