1、淫羊藿總黃酮是從淫羊藿莖葉中提取的有效部位，已證實淫羊藿總黃酮膠囊(藿酮膠囊)有良好的抗心肌缺血作用。為了減少淫羊藿總黃酮的用藥量，同時為更好更快發(fā)揮療效，用于解決冠心病危急事件，我們開發(fā)出淫羊藿總黃酮注射液(epimediumflavonoidsinjection，EFI)劑型。本研究分為兩個部分，首先對EFI進行全面系統(tǒng)的抗心肌缺血藥效學(xué)研究，然后通過體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細胞，深入探討EFI抗心肌缺血作用機制。 第一部分淫羊

2、藿總黃酮注射液抗心肌缺血的藥效學(xué)研究通過不同動物(大鼠、犬)、不同心肌缺血模型(藥物法、冠脈結(jié)扎法)，全面考察淫羊藿總黃酮注射液抗心肌缺血的藥效，同時觀察其對正常麻醉開胸犬血流動力學(xué)的影響。 一、淫羊藿總黃酮注射液對垂體后葉素致大鼠心肌缺血的保護作用將大鼠分為7組：正常對照組、模型組、陽性藥組[硝酸甘油注射液(nitroglycerin，NG)0.3mg/kg]、EFI10、20、40、60mg/kg劑量組。各組分別尾靜脈注射(

3、intravenousinjection，iv)給予相應(yīng)藥物一次，正常對照組和模型組給予等容量5％葡萄糖注射液，5min后通過舌下ivPit1.5IU/kg復(fù)制心肌缺血模型，記錄ivPit前1min及ivPit后15minECG，通過Acq3.7.2圖像分析軟件采集ST-T段變化值和心率，觀察淫羊藿總黃酮注射液(EFI)對Pit致大鼠急性心肌缺血的作用。 結(jié)果顯示：模型組ST-T段變化值與正常對照組比較，差異有非常顯著性(P＜0

4、.01或P＜0.001)；EFI10、20、40mg/kg劑量組與模型組比較，從ivPit后15s開始即可明顯降低ST-T段變化值(P＜0.05或P＜0.01)，但60mg/kg劑量組不如其他劑量組作用明顯，且有一定加快心率的作用。 結(jié)果提示：EFI對冠脈結(jié)扎致大鼠心肌缺血具有治療作用，起效快，維持時間較長，其抗心肌缺血作用可能與抗氧化機制有關(guān)。 三、淫羊藿總黃酮注射液對結(jié)扎冠脈致犬實驗性心肌梗死的治療作用采用麻醉犬冠狀

5、動脈左前降支(LAD)兩步結(jié)扎復(fù)制急性心肌梗死模型。將36只雜種犬分為6組，手術(shù)后各組行不同處理，陽性藥組iv地爾硫卓(diltiazem，Dil)0.5mg/kg，受試藥小、中、大劑量組分別iv5、10、15mg/kgEFI，假手術(shù)組(僅穿線不結(jié)扎)和模型組iv等容積5％葡萄糖注射液。通過心外膜電圖標測∑-ST和N-ST，心肌切片氯化硝基四氮唑藍(NBT)染色計算心肌梗死范圍，抽取靜脈血測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(S

6、OD)和丙二醛(MDA)，觀察淫羊藿總黃酮注射液(EFI)對犬急性心肌梗死的治療作用。 結(jié)果顯示：5、10、15mg/kgEFI均在給藥后5min起效，可劑量依賴性降低∑-ST和N-ST升高程度，在結(jié)扎冠脈后3h仍有作用，均能顯著縮小心肌梗死范圍，降低血清LDH活性和MDA水平，升高血清SOD活性。 結(jié)果提示：EFI對犬急性心肌梗死有較好的治療作用，起效較快，作用維持時間較長，其抗心肌缺血作用可能與抗氧化機制有關(guān)。

7、 四、淫羊藿總黃酮注射液對正常麻醉開胸犬血流動力學(xué)的影響將30只雜種犬分為5組，分別為：正常對照組，陽性藥組(Dil，0.5mg/kg)，淫羊藿總黃酮注射液(EFI)小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)劑量組。通過脈沖多普勒超聲血流儀和BIOPAC多導(dǎo)生理儀分別測定心輸出量、血壓和冠脈流量，心導(dǎo)管插管測定左室內(nèi)壓，記錄心電圖，觀察EFI對正常麻醉開胸犬血流動力學(xué)的影響。 結(jié)果顯示：EFI液可減慢心率，

8、升高收縮壓，短暫降低舒張壓，增加心輸出量、冠脈流量、心臟指數(shù)、左室做功指數(shù)，降低總外周阻力、冠脈阻力和左室內(nèi)壓最大變化速率，降低心肌耗氧指數(shù)，對左室內(nèi)壓無明顯影響。 結(jié)果提示：EFI可通過增加冠脈流量，增加氧的供應(yīng)，降低心肌耗氧量，改善心臟血流動力學(xué)。 第二部分淫羊藿總黃酮注射液抗心肌缺血作用機理研究在證實淫羊藿總黃酮注射液抗心肌缺血藥效的基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)心肌細胞，復(fù)制過氧化氫模型，深入研究淫羊藿總黃酮注射液抗心肌缺

9、血作用機制。 一、淫羊藿總黃酮注射液對H2O2誘導(dǎo)心肌細胞損傷的影響通過體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞，復(fù)制H2O2損傷模型，MTT法檢測心肌細胞增殖狀況，流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡，DNA瓊脂糖凝膠電泳，透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)，觀察淫羊藿總黃酮注射液(EFI)對H2O2誘導(dǎo)心肌細胞損傷的保護作用。結(jié)果顯示：H2O2可劑量依賴性增加心肌細胞抑制率；100μmol/LH2O2作用12h后PI單染心肌細胞凋亡率為(23.94±3.5

10、2)％，Annexin-V和PI雙染心肌細胞凋亡率為(64.7±3.6)％，DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型DNA梯帶，心肌細胞超微結(jié)構(gòu)呈凋亡特征性變化；100、200、400μg/mLEFI可劑量依賴性降低心肌細胞抑制率，顯著降低心肌細胞凋亡率，且能改善心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。表明100μmol/LH2O2可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細胞凋亡，EFI對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷具有保護作用。 二、淫羊藿總黃酮注射液對心肌細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的干

11、預(yù)通過體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞，復(fù)制H2O2損傷模型，檢測心肌細胞內(nèi)總抗氧化能力和超氧化物歧化酶(SOD)活性，使用熒光探針通過流式細胞儀檢測心肌細胞內(nèi)ROS水平，免疫印跡法檢測心肌細胞內(nèi)硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和SOD蛋白表達水平，觀察H2O2作用下心肌細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變及淫羊藿總黃酮注射液(EFI)對心肌細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的干預(yù)作用。結(jié)果顯示：100μmol/LH2O2作用12h后心肌細胞總抗氧化能力從正常

12、對照組的(2.16±0.84)IU/mgprot下降為(1.13±0.45)IU/mgprot，差異顯著(P＜0.01)；SOD活性從正常對照組的(18.24±4.53)IU/mgprot下降為(12.71±3.92)IU/mgprot，差異顯著(P＜0.05)；心肌細胞的平均熒光強度(MFI)從正常對照組的35±12上升到78±26，差異顯著(P＜0.01)。給予100、200、400μg/mLEFI干預(yù)后，心肌細胞總抗氧化能力分別升

13、高到(1.42±0.49)、(1.74±0.57)和(1.82±0.73)IU/mgprot，與H2O2作用組比較，200、400μg/mLEFI組均具有顯著性差異(P＜0.05)；SOD活性呈劑量依賴性升高，分別為(15.21±3.47)、(15.68±2.07)和(16.97±2.88)IU/mgprot，200、400μg/mL劑量組與H2O2作用組比較差異有顯著性(P＜0.05)；MFI呈劑量依賴性下降，分別為69±21、57±

14、16和51±18，200、400μg/mL劑量組與H2O2作用組比較，差異顯著(P＜0.05)。以正常對照組蛋白條帶灰度值為100，H2O2作用組的Trx和SOD蛋白條帶灰度相對數(shù)值分別為(30.01±8.27)和(28.72±6.64)％。在100、200和400μg/mLEFI作用下，Trx和SOD蛋白量劑量依賴性增加，其中，Trx蛋白條帶灰度相對數(shù)值分別為(36.56±7.41)、(48.69±10.23)和(65.80±12.4

15、7)％，與H2O2作用組比較，200和400μg/mLEFI組差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)；SOD蛋白條帶灰度相對數(shù)值分別為(31.18±7.50)、(47.12±10.86)和(70.31±14.09)％，與H2O2作用組比較，200和400μg/mLEFI組差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果表明H2O2可降低心肌細胞細胞總抗氧化能力和SOD活性，增高心肌細胞內(nèi)ROS水平，降低心肌細胞Trx和SOD蛋白

16、的表達，使心肌細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；EFI可增加心肌細胞總抗氧化能力和SOD活性，降低心肌細胞ROS水平，增加心肌細胞Trx和SOD蛋白的表達，促使心肌細胞處于還原狀態(tài)，對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷具有保護作用。 綜上所述，本文系統(tǒng)研究了淫羊藿總黃酮注射液抗心肌缺血藥效，并對其抗心肌缺血機制進行了探索。通過系列實驗證實：淫羊藿總黃酮注射液可保護垂體后葉素所致大鼠急性心肌缺血，對結(jié)扎冠脈致大鼠和犬急性心肌缺血均有治療作用，且起效較