1、[研究背景]
　　 面神經解剖特殊，損傷后受骨性面神經管壓迫，常形成“水腫—缺血—水腫”的惡性循環(huán)，如何預防或減輕面神經的水腫在面癱臨床治療中具有極其重要的意義。
　　 水通道蛋白(AQPs)是存在于細胞膜上，介導不同類型細胞跨膜水轉運的膜蛋白家族，與多種組織器官水腫形成和消除密切相關，在水液代謝的調節(jié)中起重要作用。其中AQP1是周圍神經系統(tǒng)表達最多的水通道蛋白。我們前期工作證實了面神經組織內存在AQP1的表達，并在小鼠

2、面神經離斷傷模型中發(fā)現面神經損傷后AQP1表達增高，與面神經損傷后水腫時相性變化高度一致，提示AQP1與面神經損傷后繼發(fā)性水腫密切相關，并進一步研究發(fā)現AQP1定位在雪旺細胞上。但是AQP1表達增高與面神經水腫的因果關系還未確定，即AQP1的高表達導致或加劇面神經水腫？還是面神經水腫伴隨AQP1的高表達尚無定論;且AQP1在雪旺細胞內如何發(fā)揮生理和病理作用也不清楚。
　　 因此，本課題應用RNA干擾和過表達技術分別下調和上調雪旺

3、細胞AQP1表達，研究AQP1表達變化在生理狀態(tài)下對雪旺細胞形態(tài)和水轉運的影響;并制作雪旺細胞CoCl2缺氧模型，模擬體內面神經損傷，研究在缺氧病理狀態(tài)下AQP1的表達變化及其對雪旺細胞形態(tài)和水轉運的影響，以確定AQP1表達與雪旺細胞腫脹的因果關系，并探討雪旺細胞缺氧損傷后誘導AQP1表達增加的可能分子機制，為臨床預防或減輕面神經水腫后的繼發(fā)損傷提供理論依據。
　　 [目的]
　　 1、探討AQP1基因表達和雪旺細胞腫脹

4、之間的因果關系;
　　 2、明確AQP1在面神經損傷后水腫中的基因功能，為臨床預防或治療面神經水腫提供新思路;
　　 3、研究雪旺細胞在缺氧病理狀態(tài)下缺氧誘導因子（HIF-1α）對AQP1表達的影響，探討雪旺細胞缺氧損傷后誘導AQP1表達增加的分子機制。
　　 [方法]
　　 1、應用細胞免疫熒光技術驗證小鼠面神經來源的原代雪旺細胞AQP1表達
　　 (1)采用酶消化法原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠面

5、神經雪旺細胞，差速貼壁法提純;
　　 (2)免疫熒光共標染色鑒定所培養(yǎng)細胞AQP1和S-100表達。
　　 2、慢病毒介導的AQP1-shRNA對小鼠雪旺細胞形態(tài)及水轉運的影響
　　 (1)小鼠AQP1-shRNA慢病毒載體構建與鑒定:對小鼠AQP1 mRNA分析，設計合成的單鏈引物經退火形成雙鏈oligo序列，連接入經AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切線性化的pLKO.1-TRC慢病毒質粒載體中，菌液PCR鑒定并經測序

6、驗證。測序正確后與慢病毒包裝輔助質粒共轉染293T細胞，收集病毒上清經高速離心濃縮后感染小鼠雪旺細胞，RT-PCR和Western blot法分析篩選有效shRNA序列;
　　 (2) AQP1-shRNA感染雪旺細胞后，與CTRL組（scr-shRNA）比較，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，連續(xù)6天;
　　 (3)細胞容積測定量化AQP1-shRNA細胞與CTRL(scr-shRNA)細胞水含量變化;
　

7、　 (4) MTT法檢測細胞增殖;
　　 (5)流式細胞術檢測AQP1-shRNA對雪旺細胞凋亡的影響。
　　 3、慢病毒介導的AQP1過表達對小鼠雪旺細胞形態(tài)及水轉運的影響
　　 (1)小鼠AQP1基因慢病毒載體構建與鑒定:將小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，通過PCR和測序鑒定獲得連接正確的克隆。將鑒定后的重組表達質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGF

8、P-AQP1與包裝質粒psPAX2、pMD共轉染293T細胞，制備攜帶AQP1基因的慢病毒Lemi-AQP1，感染雪旺細胞，RT-PCR和Westem blot檢測感染后雪旺細胞AQP1mRNA和蛋白表達情況;
　　 (2) Lenti-AQP1感染雪旺細胞后，與CTRL組(empty vector)比較，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，連續(xù)6天;
　　 (3)細胞容積測定量化Lenti-AQP1細胞與CTRL細

9、胞水含量變化。
　　 4、缺氧狀態(tài)下AQP1對小鼠雪旺細胞形態(tài)及水轉運的影響
　　 (1)制作雪旺細胞CoCl2缺氧模型，模擬體內面神經損傷，RT-PCR、Western blot、免疫熒光染色鑒定AQP1表達變化;
　　 (2) AQP1-shRNA處理后雪旺細胞，在缺氧狀態(tài)下與CTRL組比較，觀察缺氧后細胞形態(tài)變化情況，細胞容積測定鑒定細胞水含量變化。
　　 5、缺氧誘導AQP1表達增加的機制研究

10、r>　　 (1)雪旺細胞缺氧后RT-PCR、Western blot鑒定HIF-1α表達;
　　 (2)應用瞬時轉染抑制HIF-1α表達，研究HIF-1αsiRNA對AQP1蛋白表達的影響。
　　 [結果]
　　 1、小鼠原代面神經雪旺細胞表達AQP1;
　　 2、成功退火合成3對發(fā)夾shRNA序列并將其克隆到pLKO.1-TRC載體中，構建重組質粒pLKO-AQP1-SH1、2、3，經菌液PCR鑒定和

11、測序驗證載體構建成功。Realtime-PCR檢測發(fā)現重組質粒pLKO-AQP1-SH2感染雪旺細胞后AQP1 mRNA表達最低，Western blot結果進一步驗證結果的準確性;AQP1 shRNA能使雪旺細胞形態(tài)皺縮，細胞水含量明顯降低(P＜0.001);AQP1-shRNA細胞較CTRL組細胞增殖活力降低(P＜0.05)，但不會引起雪旺細胞明顯的凋亡。
　　 3、構建的慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copG

12、FP-AQP1經PCR鑒定和測序正確，慢病毒Lenti-AQP1感染雪旺細胞后AQP1mRNA和蛋白表達明顯增加;AQP1過表達使雪旺細胞腫脹，細胞形態(tài)近似圓形，細胞水含量顯著增加(P＜0.001);
　　 4、雪旺細胞缺氧后AQP1mRNA和蛋白表達水平增加，免疫熒光染色發(fā)現AQP1強烈表達在雪旺細胞膜上，細胞形態(tài)近似橢圓形;慢病毒穩(wěn)定轉染AQP1-sh細胞較scr-sh細胞缺氧后細胞腫脹不明顯(P＜0.001);
　　

13、 5、雪旺細胞缺氧后HIF-1αmRNA和蛋白表達水平增加，HIF-1αsiRNA降低了體外缺氧誘導AQP1蛋白表達水平。
　　 [結論]
　　 1、AQP1是控制雪旺細胞快速水轉運的主要因素;
　　 2、AQP1是參與雪旺細胞可塑性的一種蛋白;
　　 3、AQP1表達變化是缺血、缺氧誘導面神經水腫的主要因素;
　　 4、HIF-1α參與缺氧誘導AQP1表達增高;
　　 5、抑制AQP1