1、人臍血富含造血干/祖細(xì)胞,是骨髓與外周血以外的另一種有廣闊應(yīng)用前景的造血細(xì)胞來(lái)源。近年,臍血移植已廣泛地用于治療兒童白血病和惡性腫瘤等。然而,由于單份臍血的采集量有限,其中所含造血干/祖細(xì)胞數(shù)量難以滿足大齡兒童及成人患者的需要。造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)有望克服這一障礙。臍血造血干/祖細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖分化能力,在造血細(xì)胞因子的刺激下可大量增殖,但在擴(kuò)增同時(shí)造血干/祖細(xì)胞也不可避免地分化成熟,從而影響了其自我更新能力和多向分化潛能的保留。因此

2、,如何能既擴(kuò)增造血細(xì)胞數(shù)量又盡可能保留造血細(xì)胞性能則是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。近年,在細(xì)胞因子組合方案方面進(jìn)行了大量研究,仍未建立一條確切有效的途徑,而對(duì)于細(xì)胞周期調(diào)控的研究甚少,但作為機(jī)體細(xì)胞,造血干細(xì)胞增殖分化的根本仍是細(xì)胞周期的演進(jìn),造血干細(xì)胞增殖分化進(jìn)程不但受控于細(xì)胞因子,同時(shí)與細(xì)胞周期調(diào)控因子密切相關(guān)。
　　增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,

3、能促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。本研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間和不同培養(yǎng)條件下臍血CD34+細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平和細(xì)胞周期進(jìn)行了測(cè)定,揭示PCNA在造血調(diào)控中的重要生物學(xué)意義,為進(jìn)一步研究如何通過(guò)調(diào)控PCNA來(lái)控制造血干細(xì)胞的增殖和分化提供一定的研究基礎(chǔ)。
　　1.臍血CD34+細(xì)胞在體外擴(kuò)增中PCNA表達(dá)水平的變化
　　采用Mini MACS(magnetic activated cell sorting)分離獲得

4、CD34+細(xì)胞,培養(yǎng)于含有不同細(xì)胞因子組合的IMDM( Iscove’s modified Dulbecco’s medium,IMDM)培養(yǎng)體系中。實(shí)驗(yàn)分組:①無(wú)細(xì)胞因子組即空白對(duì)照組;②干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)+白細(xì)胞介素6(IL-6)+白細(xì)胞介素3(IL-3)組;③SCF+IL-6+IL-3+血小板生成素(Thrombopoietin,Tpo)組;④Flt3-配基(Flt3-ligand,FL)+Tp

5、o+SCF+IL-6+IL-3組。在培養(yǎng)的第3天、5天、7天收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),新鮮分離的臍血中CD34+細(xì)胞低表達(dá)PCNA,陽(yáng)性率為(11.6±5.2)％,在體外短期培養(yǎng),無(wú)細(xì)胞因子的組合PCNA表達(dá)水平逐漸下降,而在含有各細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)體系中,PCNA表達(dá)水平逐漸增高,其中以FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3組合作用最顯著。
　　2.臍血CD34+細(xì)胞在體外擴(kuò)增中細(xì)胞周期的變化。

6、>　　采用Mini MACS分離獲得CD34+細(xì)胞,在含有不同細(xì)胞因子組合(①SCF+IL-6+IL-3組;②SCF+IL-6+IL-3+Tpo組;③FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3組)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7天,在0天、3天、7天收集細(xì)胞,碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色后運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn),新鮮分離的臍血CD34+細(xì)胞95.1%處于G0/G1期,僅4.9%處于S期,在不同細(xì)胞因子組合下培養(yǎng)3