1、先天性凝血因子Ⅴ(FactorⅤ,FV)缺乏癥也稱副血友病,是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,估計在人群中發(fā)病率為1/1000000。FV缺乏癥病例的出血癥狀各不相同,雜合子病例往往無明顯的臨床出血癥狀,而純合子病例則可能有輕度到重度的出血癥狀。凝血因子Ⅴ基因(F5)的突變是遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥的主要分子基礎。至今,全世界有關遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥個例報道約200多例。查詢最新的F5基因突變數(shù)據(jù)庫,并對相關文獻進行回顧性分析發(fā)現(xiàn),已知的

2、F5基因突變有101種民,其中錯義突變46種,缺失突變27種,無義突變14種,插入突變7種,剪接突變7種。遺傳性凝血因子ⅩⅢ(FactorⅩⅢ,FⅩⅢ)缺陷癥是另外一種罕見常染色體隱性遺傳病。其主要的臨床表現(xiàn)為終生出血傾向,傷口愈合不良,習慣性流產(chǎn)等。男女均可發(fā)病,發(fā)病率約為1/2000000。自1960年Duckert等報道首例病例以來,累計報道300多例,國內僅有數(shù)例。因子ⅩⅢA鏈和B鏈基因突變是遺傳性凝血因子ⅩⅢ缺陷癥的分子基礎

3、。國際凝血因子ⅩⅢ基因突變注冊數(shù)據(jù)庫(截至2007年1月)登記的FⅩⅢA基因突變包括:34種錯義突變,21種插入/缺失突變,9種剪切位點突變,5種無義突變,FⅩⅢB基因突變僅4種。由此可見FⅩⅢ基因突變以FⅩⅢA基因突變?yōu)橹?FⅩⅢB基因突變僅占極小比例。近3年來許多國家的研究者相繼在人FⅩⅢ基因發(fā)現(xiàn)了一些新的突變。對遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥及遺傳性凝血因子ⅩⅢ進行分子水平的機制研究不僅有助于這類疾病的分子診斷,更重要的是可以為這類單基因

4、遺傳病的基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 目的:分別對一例遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥(hereditary factorⅤ deficiency,HFVD)和一例遺傳性凝血因子ⅩⅢ缺陷癥(hereditary factorⅩⅢ deficiency,HFXIIID)進行家系分析和基因分析,鑒定凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ可能存在的基因變異；以凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ基因突變?yōu)檠芯康那腥朦c,進一步從分子水平研究這些突變致病的分子特征。

5、
　　 方法:1.用凝固法對疑似病例及其家庭成員的凝血指標進行檢測,提取HFVD家系先證者及其家庭成員的外周血基因組DNA,PCR方法擴增凝血因子Ⅴ基因(F5)全部外顯子和側翼序列,DNA測序方法識別F5的基因突變或多態(tài)性。以100例健康體檢者為參考,應用等位基因特異PCR或PCR限制性酶切片段長度多態(tài)性分析方法對發(fā)現(xiàn)的突變進行確證,以排除基因多態(tài)性。2.用計算機輔助剪接位點預測程序(NetGene2)對F5剪接受體位點點突變(

6、IVS16-1G>T)的效應進行分析,并構建包含此點突變(IVS16-1G>T)的Minigene,體外試驗分析IVS16-1G>T突變對FV mRNA前體剪接的影響。應用生物信息學軟件對所發(fā)現(xiàn)突變進行分子模建,探討突變蛋白局部及空間結構的改變。構建含Tyr530Ser錯義突變和缺失60個氨基酸殘基(1779～1838)的FV基因真核表達載體,脂質體介導的基因轉移試驗觀察FV野生型和突變型重組蛋白在COS-7細胞內的表達特性。3.用尿素

7、溶解試驗和定量試劑盒法檢測HFXIIID患者及其家系成員血漿FⅩⅢ活性,并用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定相應血漿FⅩⅢ抗原含量。PCR方法擴增凝血因子ⅩⅢA基因(F13A)全部外顯子和側翼序列,DNA測序方法識別F13A的基因突變或多態(tài)性。應用直接測序、等位基因特異PCR或PCR限制性酶切片段長度多態(tài)性分析方法對發(fā)現(xiàn)的突變進行確證,以排除基因多態(tài)性。4.構建野生型FⅩⅢA重組表達質粒,定點突變方法獲得含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174

8、stop)的FⅩⅢA重組表達質粒。分別將上述重組質粒通過脂質體介導的基因轉移方法轉染到COS-7細胞表達,熒光定量RT-PCR、Western印跡及酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測轉染細胞中人FⅩⅢA的RNA表達水平和蛋白表達量。
　　 結果:1.在HFVD家系中先證者和其妹妹血漿FV活性及血漿FV抗原水平都重度減低,兩者的FV基因存在雙重雜合子突變,即Tyr530Ser及IVS16-1G>T突變,其中Tyr530Ser突變是因F5外顯子1

9、1第1763位核苷酸發(fā)生C→T雜合突變導致,而IVS16-1G>T突變是發(fā)生在F5內含子16剪接受體位點的點突變。家系分析表明Tyr530Ser突變和IVS16-1G>T突變分別遺傳自其父、母親,其父為Tyr530Ser突變攜帶者,其母為IVS16-1G>T突變攜帶者。KpnI酶切分析及等位基因特異的PCR實驗結果表明100例健康體檢者中均不存在這兩種突變。2.成功構建含有點突變(IVS16-1G>T)的F5 Minigene。NetG

10、ene2程序能夠識別野生型F5基因第16內含子受體剪接位點,不能識別發(fā)生突變的第16內含子受體剪接位點。體外將野生型和突變型F5 minigene重組體轉到COS7細胞,RT-PCR和DNA測序證實,從野生型minigene轉染組擴增得到的PCR產(chǎn)物長度為452 bp,然而從突變型minigene轉染組擴增得到的PCR產(chǎn)物長度為272 bp?；驕y序分析證明突變轉錄本恰好缺失了180 bp長的外顯子17。計算機模擬分析預測一旦530位氨

11、基酸變?yōu)镾er,將不能維系和Glu330及Tyr415之間的氫鍵。由IVS16-1G>T突變導致缺失的60個氨基酸殘基位于FV分子的A3結構域。這一缺失不僅導致FV A3結構域C端β桶結構被破壞,還導致銅離子與His1815和His1817之間協(xié)同作用的喪失。Western blot實驗證實在細胞裂解物中野生型FV和兩種突變的FVs均有表達。EIISA進一步證實Tyr530Ser和△1779-1838突變的FV抗原表達量分別降到野生型F

12、V蛋白表達量的79.5％和60.0％。野生型重組FV蛋白能夠被有效分泌到培養(yǎng)基中(FV:C60.7±19.7％；FV:Ag8.5±0.8μg/ml)。但是與轉染野生型表達質粒組比較,轉染兩種突變質粒的COS-7細胞培養(yǎng)上清中檢測到的FV抗原水平則明顯減低。預測的Tyr530SerFV突變蛋白和△1779-1838突變FV蛋白的特異性活性分別是0.012 U/μg和0.043 U/μg。3.HFXIIID家系先證者FⅩⅢ基因第3外顯子和第

13、4外顯子分別存在Arg77Cys錯義突變和Arg174stop無義突變,后者是人FⅩⅢ基因一種新突變。家系分析表明這2個突變是雙重雜合子型,Arg77Cys突變遺傳自父親,Arg174stop突變遺傳自母親。先證者女兒攜帶Arg77Cys錯義突變。先證者丈夫及100名健康對照者均未發(fā)現(xiàn)Arg77Cys錯義突變和Arg174stop無義突變。4.成功構建人FⅩⅢA表達質粒,并通過定點突變成功構建含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174

14、stop)的FⅩⅢA重組表達質粒。含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重組質粒轉染組FⅩⅢA mRNA相對表達豐度分別為0.82±0.21和0.76±0.17,與野生型FⅩⅢA重組質粒轉染組(1.06±0.51)比較沒有顯著性差異(P>0.05)。野生型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物中FⅩⅢ活性為61.6±30.4％,濃縮的細胞培養(yǎng)上清液中FⅩⅢ活性為24.0±2.9％。而兩種突變型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂

15、解物及培養(yǎng)上清液FⅩⅢ活性明顯減低。轉染細胞裂解物的Western Blot分析發(fā)現(xiàn)含Arg77Cys錯義突變的FⅩⅢA重組蛋白在培養(yǎng)細胞內含量嚴重減低,僅見一條微弱的條帶。ELISA證實野生型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量為32.8±14.5％％,濃縮的細胞培養(yǎng)上清液中FⅩⅢ:Ag量為13.2±2.3％。而兩種突變型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物及培養(yǎng)上清液中FⅩⅢA:Ag水平極度減低,低于ELISA檢測低限。

16、>　　 結論:1.在一個遺傳性HFVD家系中證實先證者和其同胞妹妹均為F5Tyr530Ser突變及IVS16-1G>T突變的雙重雜合子。兩例患者均表現(xiàn)為重度凝血因子Ⅴ缺乏,提示F5 Tyr530Ser突變及IVS16-1G>T突變共同導致了凝血因子Ⅴ功能的嚴重缺陷。2.體外COS-7細胞轉染實驗證實IVS16-1G>T。突變確實可以導致F5第17號外顯子跳躍(Skipping),將因此導致合成缺陷型FV蛋白,其A3結構域內缺失60個氨

17、基酸殘基(從1779-1838共60個氨基酸)。兩種FV突變體的體外表達實驗結果提示Tyr530Ser突變和IVS16-1G>T突變單獨都可以導致FV重組蛋白表達量的嚴重減低,因此與FV重度缺乏密切相關。3.發(fā)現(xiàn)人FⅩⅢ基因一種新突變,即Arg174stop無義突變,并成功建立此突變的PCR限制性片段長度多態(tài)性檢測方法。先證者因子ⅩⅢ基因同時存在Arg77Cys錯義突變和Arg174stop無義突變,可能是其因子ⅩⅢ色天性缺陷的因為。4