1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性侵蝕性周圍關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫病。雖然其確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RA是在遺傳和環(huán)境因素作用下由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，CD4+T細(xì)胞的分化異常和功能紊亂是其發(fā)病的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為RA是Th1細(xì)胞占優(yōu)勢的疾病。然而，清除或中和Th1型細(xì)胞因子IFN-γ或IL-12，不能預(yù)防或減輕疾病進(jìn)程。隨后的研究發(fā)現(xiàn)IL-17在RA發(fā)病中有重要作用，

2、IL-17可刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)，軟骨破壞及血管翳形成。動物實驗證實缺失分泌IL-17的T細(xì)胞可以使RA的發(fā)病受到抑制。因此，目前眾多學(xué)者認(rèn)為Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的IL-17是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵因素，抑制Th17細(xì)胞反應(yīng)可能有利于RA病情緩解。
　　 基于上述理論和研究結(jié)果，我們推測CCK-8有可能通過調(diào)節(jié)DC表型和細(xì)胞因子分泌來調(diào)控CD4+T細(xì)胞的活化與分化，并進(jìn)一步對RA的發(fā)病和

3、轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響。據(jù)此，本課題在體外細(xì)胞實驗和疾病實驗動物模型整體水平系統(tǒng)分析了CCK-8對DC功能的影響及其對CD4+T細(xì)胞活化與分化的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步觀察了CCK-8對RA實驗動物模型-膠原誘導(dǎo)型小鼠關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）發(fā)病和關(guān)節(jié)病變的影響。1CCK-8體外作用DC對抗原特異性T細(xì)胞分化的影響
　　 第一部分:
　　 目的：DC活化過程中表達(dá)的協(xié)同刺激分子水平和分泌的細(xì)

4、胞因子類型影響T細(xì)胞的活化和分化方向。調(diào)節(jié)DC成熟過程中的表面分子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌將會對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生不同的影響。本部分研究主要采用體外細(xì)胞實驗觀察CCK-8對LPS誘導(dǎo)DC成熟過程中細(xì)胞表型和功能的影響，及其對抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：骨髓細(xì)胞自DBA/1J小鼠股骨和脛骨骨髓中分離，在含有GM-CSF的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～7天，收集懸浮和疏松貼壁細(xì)胞，作為骨髓來源的DC（bone

5、marrow-derived dendritic cell，BM-DC）使用。（1）將BM-DC分為五組：Medium組（只加培養(yǎng)基）：LPS組（1μg/ml）；LPS（1μg/ml）+CCK-8（10-6、10-8、10-10mol/L）。將細(xì)胞按上述條件培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，分別同時加入PE-抗CD11c抗體和FITC-抗CD80、FITC-抗CD86或FITC-抗MHCII抗體，孵育30min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。分析CD11

6、c+細(xì)胞表面CD80、CD86和MHCII表達(dá)量的變化。（2）用CD11c+免疫磁珠分選BM-DC獲得純化的DC（purifled BM-DC，pBM-DC），將pBM-DC分為五組：Medium組（只加培養(yǎng)基）；LPS組（1μg/ml）；LPS（1μg/ml）+CCK-8（10-6、10-8、10-10 mol/L）。將細(xì)胞按上述條件培養(yǎng)24h。①收集上清，ELISA法檢測IL-23含量；②收集細(xì)胞，用50μg/ml絲裂霉素C（mit

7、omycin-C，MMC）37℃孵育1h后，與免疫磁珠分選的CII特異性CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，采用MTS法測定T細(xì)胞增殖，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β含量。
　　 結(jié)果：（1）未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的未成熟BM-DC表達(dá)較低水平的CD80、CD86和MHCII，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的成熟BM-DC CD80、CD86和MHCII表達(dá)顯著增高，一定濃度的CCK-8與LPS同時作用則顯著抑制了BM-DC

8、 CD80、CD86和MHCII表達(dá)，提示CCK-8可抑制LPS誘導(dǎo)BM-DC表型成熟。（2）未成熟pBM-DC分泌IL-23的能力非常低，低于試劑盒檢測的下限。經(jīng)LPS誘導(dǎo)的成熟pBM-DC分泌IL-23的水平明顯升高，10-6和10-8mol/L CCK-8處理則顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-23分泌（P<0.05），10-10mol/L CCK-8處理作用效果不明顯。（3）LPS誘導(dǎo)的成熟pBM-DC作為APC能顯著刺激抗原特異性CD

9、4+T細(xì)胞增殖，不同濃度CCK-8與LPS同時作用pBM-DC后則明顯降低pBM-DC的刺激能力，CD4+T細(xì)胞的增殖活性下降（P<0.05）。（4）與未成熟pBM-DC相比，LPS誘導(dǎo)的成熟pBM-DC可刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生高水平IFN-γ和IL-17，一定濃度的CCK-8與LPS共同作用pBM-DC與LPS組相比顯著提高IFN-γ的水平（P＜0.05），降低IL-17的產(chǎn)生（P<0.05），不同濃度CCK-8與LPS同時作用pBM

10、-DC對CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和TGF-β的水平無明顯影響（P>0.05）。
　　 第二部分：
　　 目的：第一部分體外細(xì)胞實驗證實，CCK-8通過調(diào)節(jié)DC成熟過程中的細(xì)胞表型和細(xì)胞因子分泌對抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本部分研究我們將在疾病實驗動物模型整體水平觀察CCK-8對DC和CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：采用雞CII加弗氏完全佐劑的乳化液免疫RA易感動物DBA/1J小鼠

11、，建立CIA模型。小鼠隨機(jī)分為四組：生理鹽水對照組；CCK-8 lnmol組；CCK-8 5nmol組；CCK-8 10nmol組。各組小鼠于第二次增強(qiáng)免疫同時，腹腔注射以上藥物，每天注射1次，連續(xù)注射7天。于第一次免疫后28天，取各組小鼠腹股溝引流淋巴結(jié)：（1）采用流式細(xì)胞雙標(biāo)術(shù)檢測CD11c+細(xì)胞表面CD80、CD86和MHCII表達(dá)。（2）提取總RNA，采用熒光定量RT-PCR法檢測IL-12p35、IL-12p40、IL-23p

12、19、IL-6、T-bet（T-box expressed in T cells）、Gata-3（GATA binding protein 3）、RORγt（orphan nuclear receptor gammat）、Foxp3（foxhead/winged-helix box protein 3）、IFNγ、IL-4、IL-17和TGF-β mRNA表達(dá)。（3）免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，經(jīng)CII刺激，MTS法檢測細(xì)胞增殖，ELI

13、SA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的含量。
　　 以上結(jié)果表明：CCK-8腹腔注射CIA小鼠能夠下調(diào)DC表面CD80、CD86和MHCII表達(dá)，并通過抑制IL-6和IL-23的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-12的產(chǎn)生，抑制CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向Thl和Treg細(xì)胞分化。3 CCK-8對CIA發(fā)病和關(guān)節(jié)病變的影響
　　 第三部分：
　　 目的：目前研究表明Th17細(xì)胞通過分泌IL

14、-17在RA發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題前兩部分體內(nèi)外實驗證實，CCK-8通過調(diào)節(jié)DC細(xì)胞表型和細(xì)胞因子分泌對抗原特異性CD4+T細(xì)胞的活化和分化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，尤其是抑制抗原特異性Th17細(xì)胞反應(yīng)，提示CCK-8可能會延緩或防止RA發(fā)病。因此，本部分實驗我們建立CIA模型，觀察CCK-8對RA發(fā)病的影響。
　　 方法：CIA模型的建立及分組處理同第二部分。于第二次增強(qiáng)免疫同時，隔日對小鼠發(fā)病率及關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行觀測。于第一次免疫后

15、35天，（1）取小鼠后肢踝關(guān)節(jié)觀察組織病理改變；（2）取小鼠后肢踝關(guān)節(jié)提取組織蛋白，檢測各種炎性細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)因子水平：（3）留取小鼠血清檢測抗CII特異性抗體及其亞型水平。
　　 結(jié)果：結(jié)果表明：CCK-8能有效抑制CIA發(fā)病，降低發(fā)病率、推遲發(fā)病時間、降低關(guān)節(jié)病理損傷程度。CCK-8發(fā)揮作用的機(jī)制主要與其抑制抗原特異性Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　 結(jié)論：本研究系統(tǒng)分析了CCK-8體內(nèi)外作用對D

16、C功能的影響及其對抗原特異性CD4+T細(xì)胞活化和分化的調(diào)節(jié)作用，在此基礎(chǔ)上觀察了CCK-8對CIA發(fā)病和關(guān)節(jié)病變的影響。得出以下結(jié)論：
　　 1、CCK-8體外作用通過調(diào)節(jié)DC成熟過程中的細(xì)胞表型和細(xì)胞因子分泌對抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。通過上調(diào)IL-12的產(chǎn)生促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，下調(diào)IL-6和IL-23的產(chǎn)生抑制Th17細(xì)胞分化和擴(kuò)增。
　　 2、CCK-8體內(nèi)作用CIA小鼠同樣能夠下調(diào)DC表面

17、CD80、CD86和MHCII的表達(dá)，抑制IL-6和IL-23 p19 mRNA表達(dá)，促進(jìn)IL-12 p35和p40mRNA表達(dá)，抑制CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向Thl和Treg細(xì)胞分化。
　　 3、CCK-8能有效抑制CIA發(fā)病，降低發(fā)病率、推遲發(fā)病時間、降低關(guān)節(jié)病理損傷程度。
　　 總之，CCK-8腹腔注射CIA小鼠可有效抑制發(fā)病，降低發(fā)病率、減輕關(guān)節(jié)病理損傷。CCK-8可通過多靶點發(fā)揮作用，其中最主要