1、 本課題研究在探討低氧預(yù)處理(hypoxiapreconditioning，HPC)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IEC-6表達(dá)內(nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin的可行性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用腸上皮細(xì)胞IEC-6復(fù)制輻射損傷的模型，采用Westernbolt、DNA電泳、細(xì)胞流式技術(shù)等現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法，研究?jī)?nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin對(duì)輻射誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞凋亡的影響，并從Caspase-9/6、-3的表達(dá)與激活、染色體DNA損傷、細(xì)胞凋亡率等方面探

2、討內(nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理和可能的作用靶點(diǎn)，為闡明低氧預(yù)處理誘導(dǎo)正常組織細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin的可行性，尤其是在肯定內(nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，及其揭示Survivin在抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制等方面，提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題研究采用2％O2、37℃的HPC方法，對(duì)腸上皮細(xì)胞IEC-6分別進(jìn)行6、8、10h低氧，后復(fù)氧24、4

3、8h，可誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)蛋白Survivin的表達(dá)，且低氧8h復(fù)氧48h組表達(dá)效果最佳。說(shuō)明采用低氧預(yù)處理，這一廣泛運(yùn)用于心、腦血管疾病治療成熟的技術(shù)，是可以誘發(fā)符合生理特征的內(nèi)源性抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)。 35Gy60Co照射后3hIEC-6細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)，6h達(dá)到凋亡高峰，12h、24h凋亡率有所下降約，但均非常顯著地高于對(duì)照值(P＜0.01)。且細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征、染色體DNA出現(xiàn)

4、特征性的片段化。35Gy60Co照射后Caspase-9/6、-3的激活在3h與對(duì)照值比較明顯升高(P＜0.01)，6h達(dá)到高峰，12h、24h有所下降約25％，非常顯著地高于對(duì)照值(P＜0.01)，與細(xì)胞凋亡率的變化相吻合。應(yīng)用Caspase-3的特異性抑制劑z-DEVD.fmk100umol預(yù)處理培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞IEC-62h，然后暴露于輻射，在輻射后不同時(shí)間檢測(cè)Caspase-3活性，發(fā)現(xiàn)Caspase-3活性僅在輻射24h表現(xiàn)出

5、顯著上升(P＜0.01)，較單純放射組細(xì)胞損傷出現(xiàn)的遲而低，且細(xì)胞存活率下降也表現(xiàn)出遲而輕。提示Caspase-3活化與輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有密切關(guān)系。 經(jīng)低氧8h復(fù)氧48h后，給予35Gy60Co照射，細(xì)胞凋亡率在3h與單純放射組比較明顯下降(P＜0.05)，6h達(dá)到凋亡高峰，12h、24h凋亡率下降約8％，非常顯著地低于單純放射組(P＜0.01)。細(xì)胞凋亡所表現(xiàn)出的典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征和染色體DNA特征性的片段化都較單純放射

6、組輕。提示HPC可有效的抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 應(yīng)用Surrvivin的特異性抑制劑SURV11A預(yù)處理培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞IEC-62h，然后暴露于低氧/復(fù)氧，隨后給予35Gy60Co照射，不同時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明拮抗Survivin的活性可使腸上皮細(xì)胞IEC-6凋亡率提高，說(shuō)明Survivin在HPC對(duì)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用中起重要的作用。 HPC后，給予輻射照射，Caspase-9/6、-3的激活均表現(xiàn)出

7、在3h與單純放射組比較明顯下降(P＜0.05)，6h達(dá)到高峰，12h、24h有所下降約39％，非常顯著地低于單純放射組(P＜0.01)。提示Survivin抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)位于Caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)中。應(yīng)用Survivin特異性抑制劑SURV11A預(yù)處理培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞IEC-62h，然后同上實(shí)驗(yàn)條件下，在提高IEC-6細(xì)胞凋亡率的同時(shí)，有效上調(diào)了Caspase-3的活性，明顯高于低氧+放射組(P＜0.01)，但Casp