1、目的：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，檢測(cè)分化抑制因子(inhibitors of differentiation，Id)在健康志愿者、急性非淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病白細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討Id基因表達(dá)與急性非淋巴細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病的相關(guān)性，為白血病的診斷、治療提供參考。 方法：分別收集20例健康自愿者(

2、healthy volunteers，HV)新鮮外周靜脈血，16例急性菲淋巴細(xì)胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia,ANLL)和10例慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)新鮮外周靜脈血，采用密度梯凄離心法分離白細(xì)脆，分別加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3％ Dextron T-500沉淀紅細(xì)胞，小心混勻后靜置30min，磷酸鹽緩沖液(Phosphate-b

3、uffered saline PBS)充分混勻洗滌2次，采用密度梯度離心法離心，棄上清液加入紅細(xì)胞裂解液充分裂解紅細(xì)胞，離心，棄上清液加入PBS洗滌2次，棄上清液收集外周血白細(xì)胞。Trizol試劑提取各組樣本白細(xì)胞總RNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280的比值及各組樣本外周血白細(xì)胞總RNA的含量，計(jì)算出各組的RNA的濃度與純度。用1.5％的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)健康自愿者、急性非淋巴細(xì)胞白血病患者、慢性粒細(xì)胞白血病患者外

4、周血自細(xì)胞總RNA分子的完整性。 利用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的Id基因各亞型(Id1，Id2，Id3，Id4)的特異引物進(jìn)行體外擴(kuò)增。以β-action基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，統(tǒng)計(jì)并分析各組樣本在相同標(biāo)準(zhǔn)化條件下DNA擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在差異。 結(jié)果； ①RT-PCR分別擴(kuò)增健康自愿者、急健非淋巴細(xì)胞白血病患者、

5、慢性粒細(xì)胞白血病患者中Id1，Id2，Id3，Id4四種目的基因和內(nèi)參對(duì)照β-action基因的cDNA產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比較顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為494bp，354bp，170bp，170bp和527bp，與預(yù)期理論值大小一致。 ②將Id1，Id2，Id3和Id4四種目的基因與內(nèi)參照β-action基因的比值，分別在健康自愿者、急性非淋巴細(xì)胞自血病患者、慢性粒細(xì)胞自血病患者組中半定量表達(dá)的情況經(jīng)過(guò)單因素方差分析和

6、SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，四種Id基因亞型在健康自愿者和急性非游巴細(xì)胞白血病患者、慢性粒細(xì)胞白血病患者白細(xì)胞中的表達(dá)各不相同。Id1基因在健康自愿者外周血自細(xì)胞中表達(dá)較高，但在急性非淋巴細(xì)胞白血瘸患者、慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)降低(P<0.001，P<0.042)。Id2基因在健康自愿者外周血白細(xì)胞中表達(dá)較低，但在急性非淋巴細(xì)胞白血病患者、慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)增高(P<0.01，P<0.039)

7、。Id3基因在健康自愿者外周血自細(xì)胞中表達(dá)較高，但在急性非淋巴細(xì)胞白血病患者和慢性粒細(xì)胞白血瘸患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)降低(P<0.002,P<0.046)。Id4基因在健康自愿者外周血白細(xì)胞中表達(dá)較高，但在急性非淋巴白血病患者和慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)降低(P<0.011，P<0.025)。 結(jié)論：Id基因四種亞型Id1，Id2，Id3和Id4，分別在正常人、急性非淋巴細(xì)胞白血病患者和慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血白細(xì)