1、本研究建立了雞胚卵巢生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究了人參皂甙、促性腺激素和性激素對(duì)生殖細(xì)胞增殖的調(diào)控及其機(jī)理和異黃酮植物雌激素一大豆黃酮對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，并在細(xì)胞水平對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了深入探討。同時(shí)，以伊莎雞和絲羽烏骨雞為研究對(duì)象，在體內(nèi)從整體、分子等不同水平探討了大豆黃酮對(duì)雞產(chǎn)蛋性能的影響及其卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，其結(jié)果為大豆黃酮在蛋雞生產(chǎn)上的應(yīng)用及提高禽類特別是地方品種禽類的生產(chǎn)性能提供了科學(xué)的理論依據(jù)。 1．

2、雞胚卵巢生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及其驗(yàn)證和應(yīng)用 探索雞胚卵巢生殖細(xì)胞分離培養(yǎng)的簡易方法及條件，為深入研究內(nèi)源性激素和異黃酮類植物雌激素對(duì)卵巢生殖細(xì)胞發(fā)育的影響及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。采用機(jī)械分散加膠原酶分解法分離18胚齡雞胚卵巢細(xì)胞，體外共培養(yǎng)生殖細(xì)胞和體細(xì)胞，并用c-kit單克隆抗體進(jìn)行生殖細(xì)胞的鑒定。結(jié)果表明添加10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10<'-8>mol/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液(稱ITS培養(yǎng)液)能

3、較好地維持生殖細(xì)胞的存活和增殖。此外，采用c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行了特異性鑒定，結(jié)果顯示卵巢生殖細(xì)胞呈c-kit染色陽性，而體細(xì)胞呈c-kit染色陰性。同時(shí)利用該模型研究了人參皂甙(GS)對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。結(jié)果顯示GS(0.1～10μg/mL)可明顯提高生殖細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05)，蛋白激酶C(PKC)激活劑Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA，10<'-8

4、>～10<'-8>M)可增強(qiáng)這種促進(jìn)作用，而PKC抑制劑H<,7>(10<'-7>～10<'-5>M)則減弱了這種促進(jìn)作用，并都呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞增殖核抗原一標(biāo)記指數(shù)(PCNA-LI)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示出與生殖細(xì)胞數(shù)目變化相似的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明GS能夠促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖，PKC信號(hào)途徑可能參與了GS對(duì)卵巢生殖細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以作為評(píng)價(jià)激素、激素樣作用的外源性物質(zhì)對(duì)卵巢生殖細(xì)胞體

5、外增殖調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2．FSH對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究 利用生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究了FSHX對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。18胚齡雞胚卵巢細(xì)胞在培養(yǎng)的同時(shí)用FSH和腺苷酸環(huán)化酶(AC)的激活劑Forskolin(FRSK)、PKA抑制劑H<,89>、PKC激活劑PMA、PKC抑制劑H<,7>單獨(dú)或聯(lián)合處理。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)生殖細(xì)胞數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細(xì)胞，統(tǒng)

6、計(jì)生殖細(xì)胞的PCNA-LI。結(jié)果顯示FSH(10～1000ng/mL)可明顯提高生殖細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05)，F(xiàn)RSK(10<'-7>～10<'-5>M)和IPMA(10<'-8>～10<'-6>M)可增強(qiáng)這種促進(jìn)作用，而H<,89>(10<'-7>～10<'-5>M)和H<,7>(10<'-7>～10<'-5>M)則分別減弱了FSH的促進(jìn)作用，并都呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。PCNA-LI統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示出與生殖細(xì)胞數(shù)目變化相似的趨勢(shì)。以上結(jié)

7、果表明FSH能夠促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖，PKA和PKC信號(hào)途徑可能都參與了FSH對(duì)卵巢生殖細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。 3．雄激素對(duì)培養(yǎng)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)理的研究 實(shí)驗(yàn)利用已建立的生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究了雄激素對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)理。卵巢細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)用睪酮(testosterone，T)和雄激素受體阻斷劑F1utamide(FLU)、雌激素受體阻斷劑Tamoxifen(TAM)、芳香化酶

8、抑制劑Letrozole(LET)單獨(dú)或聯(lián)合處理。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)生殖細(xì)胞數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)生殖細(xì)胞PCNA-LI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T(10<'-8>～10<'-6>M)明顯提高了生殖細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05)，這種促進(jìn)作用可被FLU(10～1000ng/mL)、TAM(10～1000ng/mL)、LET(10<'-9>～10<'-7>M)所阻斷，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，PCNA-LI進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。以上結(jié)果表明

9、，生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以作為評(píng)價(jià)激素對(duì)卵巢生殖細(xì)胞體外增殖調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。T可以通過雄激素樣和雌激素樣兩種作用方式促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞的增殖。 4．大豆黃酮對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)理的研究 利用生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究了植物雌激素大豆黃酮(DAI)對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖作用的雌激素樣作用和抗氧化作用。卵巢細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)用DAI和雌激素受體阻斷劑TAM單獨(dú)或聯(lián)合處理。處理48h后，計(jì)數(shù)生殖細(xì)胞的

10、數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)生殖細(xì)胞的PCNA-LI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAI可顯著提高生殖細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05)，且這種促進(jìn)作用可被TAM所阻斷。同時(shí)，生殖細(xì)胞PCNA-LI與生殖細(xì)胞數(shù)目變化呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步研究DAI的抗氧化作用，卵巢細(xì)胞被暴露于次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)。通過測(cè)定超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽水平的變化對(duì)系統(tǒng)抗氧化性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。處在活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)中的卵巢細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，這種損傷可被DAI，DA

11、I+TAM明顯緩解(P<0.05)。這些結(jié)果表明DAI可通過雌激素樣作用促進(jìn)卵巢生殖細(xì)胞增殖，同時(shí)可以通過抗氧化特性緩解活性氧引起的細(xì)胞毒性作用。 5．大豆黃酮對(duì)伊莎雞和絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性能和卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 探討了DAI對(duì)伊莎雞和絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性能及不同發(fā)育階段卵泡中相關(guān)基因，包括促性腺激素受體(FSHR、LHR)、芳香化酶(P450arom)和催乳素受體(PRLR)mRNA表達(dá)的影響。分別隨機(jī)選取16只產(chǎn)蛋后

12、期伊莎雞或絲羽烏骨雞，等分為大豆黃酮組和對(duì)照組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加10mg/kgDAI，逐日記錄產(chǎn)蛋個(gè)數(shù)、產(chǎn)蛋重，實(shí)驗(yàn)持續(xù)7周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)采集20枚蛋，分離蛋白和蛋黃，并稱重；取出小黃卵泡和大白卵泡，分離排卵前卵泡(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3……)的顆粒層，通過相對(duì)定量RT-PCR法檢測(cè)FSHR、LHR、P450arom和PRLR mRNA表達(dá)的相對(duì)豐度，同時(shí)比較DAI對(duì)絲羽烏骨雞和伊莎雞的影響強(qiáng)度。結(jié)果顯示，F(xiàn)S

13、HR、LHR、P450arom、PRLR在伊莎雞/絲羽烏骨雞不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá)存在差異，DAI明顯提高了產(chǎn)蛋晚期伊莎雞/絲羽烏骨雞的產(chǎn)蛋率及小黃卵泡、大白卵泡的數(shù)量，顯著降低了絲羽烏骨雞卵泡閉鎖率，平均蛋重及排卵前卵泡數(shù)目也都存在增多趨勢(shì)：部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四種基因mRNA表達(dá)的相對(duì)豐度顯著增加，絲羽烏骨雞對(duì)DAI表現(xiàn)出比伊莎雞更高的敏感性。以上結(jié)果表明，在產(chǎn)蛋后期伊莎雞/絲羽烏骨雞基礎(chǔ)日糧中添加

14、DAI能夠顯著提高產(chǎn)蛋性能和不同發(fā)育階段卵泡數(shù)目，降低卵泡閉鎖率，并且上調(diào)部分卵泡中相關(guān)基因的表達(dá)以促進(jìn)卵泡發(fā)育。 綜上所述，本研究建立了雞胚卵巢生殖細(xì)胞一體細(xì)胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)c-kif可以對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行特異性鑒定。通過人參皂甙、促性腺激素和性激素對(duì)生殖細(xì)胞增殖的調(diào)控及其機(jī)理研究，對(duì)該模型進(jìn)行了有效評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)GS能夠促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增殖，PKC信號(hào)途徑可能參與GS對(duì)卵巢生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)；FSH能夠促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞增

15、殖，PKA和PKC信號(hào)途徑都可能參與了其對(duì)卵巢生殖細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)；T可以通過雄激素樣和雌激素樣兩種作用方式促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞的增殖。DAI可通過雌激素樣作用顯著促進(jìn)卵巢生殖細(xì)胞的增殖，且可以通過抗氧化特性緩解活性氧引起的細(xì)胞毒性作用；同時(shí)，DAI明顯提高了產(chǎn)蛋晚期伊莎雞和絲羽烏骨雞的產(chǎn)蛋性能及不同發(fā)育階段卵泡數(shù)量，顯著降低了絲羽烏骨雞卵泡閉鎖率；顯著上調(diào)了部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四種基因mRNA的表達(dá)水平。