1、[研究背景]：組織因子是一種含有糖基的單鏈跨膜蛋白，分子量47KD。組織因子是啟動凝血的關鍵因子，它可以同時激活凝血因子Ⅸ和X，從而啟動內、外源性兩種凝血酶聯放大反應，在凝血過程中起著重要作用。隨著對組織因子研究的加深，現在已知組織因子可以不僅作為凝血因子啟動凝血途徑，而且在動脈粥樣硬化、胚胎血管發(fā)育、腫瘤生長和轉移、炎癥、信號轉導中都具有重要的作用。 鑒于組織因子在多種生理和病理過程中起著重要的作用，對其表達進行調控就可以干預

2、組織因子相關疾病的病理進程，因此針對調控組織因子表達的研究具有重大的理論意義和臨床實用價值。研究表明，組織因子的表達主要在轉錄水平上受調控，它的啟動子區(qū)包含有：5個SP1、3個Egr～1、2個AP-1、1個NF-k B位點。其中SP1位點主要負責調控組織因子的本底水平的組成性表達，而Egr-1、AP-1和NF-kB位點則主要負責內皮細胞和單核細胞中誘導性組織因子的表達。 應用人單核細胞系THP-1細胞研究組織因子表達的研究證實，

3、存在一個56bp的增強子(-227-172)介導人組織因子的產生。這個啟動子含有一個NF-kB位點和兩個AP-1位點，這三個位點對誘導性組織因子的產生是必需的。 在以往的研究中，p65/c-Rel被認為是作用于組織因子啟動子中的NF-kB位點的主要Rel家族蛋白二聚體，但是對于p50/p65是否可以調控組織因子則沒有深入而系統(tǒng)的研究。在Rel家族蛋白形成的二聚體，含量最豐的二聚體是p50/p65，p50/p65是NF-k B信號

4、通路的主要執(zhí)行因子，所以探討其是否可以調控組織因子的表達具有理論意義和臨床應用價值。雖然p50自身不能活化轉錄，但是p65的進核需要依賴p50，只有p50和特定的DNA靶序列結合以后，p65才能發(fā)揮其活化作用。既然p65發(fā)揮調控基因作用的前提是p50能否結合到靶DNA序列，因此探討p50是否可以與組織因子啟動子中的NF-kB位點結合就可以明確p50/p65是否可以調控組織因子的表達。 [目的]：本研究旨在探尋： (1)核

5、因子-kB p50亞基是否調控組織因子的表達； (2)核因子-k B p50亞基調控組織因子在實驗性動脈內膜增生中的作用； (3)初步篩選靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物。 [研究方法]：本研究分為體外實驗和體內實驗兩部分。 一.體外實驗：探尋核因子-k B p50亞基調控組織因子表達的分子機制。 (一)分離并培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞、小鼠肺靜脈內皮細胞、人外周單核細胞及小鼠腹腔巨

6、噬細胞備用。 (二)用核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內酯預處理人及小鼠的內皮細胞和巨噬細胞，再用脂多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細胞，然后應用組織因子活性測定技術、蛋白免疫印記技術檢測通過穿心蓮內酯藥物干預或/和p50基因敲除是否可以起到下調活化的內皮細胞和白細胞組織因子表達的作用。 (三)應用細胞轉染和熒光素酶報告基因實驗以證明穿心蓮內酯阻止核因子～k B p50亞基與TF-kB位點(組織因子啟動子

7、中NF-kB結合的位點)的結合，2而不是AP-1，Sp1和Egr-1位點。 (四)分別應用電泳遷移率變動分析、染色體免疫沉淀兩種技術手段證明p50是否可以與人組織因子啟動子中的TF-KB位點結合。 (五)將人臍靜脈血管內皮細胞、小鼠肺靜脈內皮細胞、人外周單核細胞、小鼠腹腔巨噬細胞按照5000個/孔的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，應用細胞增值實驗(MTT)明確穿心蓮內酯有無細胞毒性。 二．體內實驗：證明核因子-k

8、B p50亞基對組織因子表達調控的功能重要性。 (一)將實驗動物進行如下分組：(1)C57鼠只進行左側頸總動脈結扎而不給予任何藥物，作為正常模型組；(2)C57鼠在左側頸總動脈結扎后給予穿心蓮內酯治療，作為藥物實驗組；(3)C57鼠在動脈結扎后給予DMSO(溶解穿心蓮內酯的溶劑)治療，作為溶劑陰性對照組；(4)C57鼠在動脈結扎后給予氫化穿心蓮內酯(穿心蓮內酯的非活性形式)治療，作為藥物陰性對照組；(5)C57鼠進行左側頸總動脈

9、結扎后給予穿心蓮內酯加組織因子抗體復合治療；(6)C57鼠在動脈結扎后給予組織因子抗體治療;(7)C57鼠在動脈結扎后給予IgG治療，作為組織因子抗體治療組的陰性對照組；(8)p50敲除鼠只進行左側頸總動脈結扎而不給予任何藥物；(9)p50敲除鼠進行左側頸總動脈結扎后給予穿心蓮內酯治療；(10)p50敲除鼠進行左側頸總動脈結扎后給予組織因子抗體治療；(11)B6野生對照鼠，該組動物只進行動脈結扎而不給予任何藥物，作為野生鼠正常模型組。

10、 (二)通過結扎實驗動物左側頸總動脈完成實驗性動脈內膜增生的動物模型。 (三)利用H&E染色、EVG染色技術顯示血管的彈性膜，統(tǒng)計各實驗組之間增生內膜、內膜/中膜比值之間的差異，評價單獨或復合應用穿心蓮內酯治療、組織因子多克隆抗體治療、p50基因敲除在實驗性動脈內膜增生中的作用。 (四)利用免疫組化、免疫灰度統(tǒng)計、免疫熒光共定位等技術，觀察穿心蓮內酯治療和p50敲除對組織因子、E-selectin、VCAM-1表達

11、的影響。 (五)獲取人動脈脈管炎標本，應用免疫組化技術了解NF-kB目標蛋白如組織因子、E-selectin、VCAM-1等和臨床疾病的相關性。 [結果]：本研究的實驗數據表明： (1)從p50敲除鼠分離的內皮細胞和巨噬細胞活化后，組織因子的表達減少； (2)穿心蓮內酯能夠抑制活化內皮細胞和巨噬細胞組織因子的表達； (3)p50蛋白能與人組織因子啟動子中的TF-kB位點結合，穿心蓮內酯特異性地抑制

12、p50結合到TF-k B； (4)抑制p50蛋白或敲除P50基因可以減輕動脈內膜增生； (5)取材于本研究體內實驗的的組織標本證明，浸潤的巨噬細胞、活化的內皮細胞及平滑肌細胞表達組織因子； (6)抑制p50蛋白或者敲除p50基因可以減少動脈內膜增生中組織因子的表達； (7)抑制p50蛋白敲除P50基因可以下調動脈增生內膜中E-selectin、VCAM-1的表達； (8)應用組織因子多克隆抗體阻斷

13、組織因子的活性可以減輕動脈內膜增生； (9)在人的動脈血栓中，NF-k B調控的目標基因也有高表達； (10)15uM穿心蓮內酯不抑制細胞生長，無明顯的細胞毒性。 [結論]： (1)本研究首次明確地證明了核因子-k B p50亞基可以與人組織因子啟動子中的TF-kB位點結合，從而發(fā)揮對組織因子的調控作用； (2)利用熒光素酶報告基因實驗，本研究證明了穿心蓮內酯阻止了核因子-k B p50亞基與TF

14、-kB位點的結合； (3)核因子-k B p50亞基對組織因子的調控在實驗性動脈內膜增生中起著重要的作用； (4)核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內酯可以顯著減緩實驗性動脈內膜增生的進程。E-selectin、VCAM-1、組織因子的表達在穿心蓮內酯治療鼠中均有顯著的下調； (5)靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物穿心蓮內酯經過進一步修飾有可能成為治療血栓和炎癥相關疾病的新藥。 總