1、[目的]： 1.白細胞介素21(IL-21)是一類新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，具有多種生物功能，包括對T細胞和自然殺傷細胞的調(diào)控，免疫保護，抗腫瘤作用，調(diào)控骨髓瘤細胞生長等。近年來，利用乳腺生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的熱點。本研究構(gòu)建了一類含人IL-21(hIL-21)基因的隨機整合載體，通過體細胞克隆把整合有hIL-21基因的胚胎移植到山羊子宮，希望能在該胚胎發(fā)育來的轉(zhuǎn)基因山羊乳腺中表達hIL-21蛋白，從而為大規(guī)

2、模生產(chǎn)hIL-21奠定基礎(chǔ)。 2.β-酪蛋白位點的基因打靶效率十分低下，成功進行了基因打靶的研究還未有報道。為了探尋一種能夠提高打靶效率的方法，我們利用構(gòu)建好的山羊β-酪蛋白位點hIL-21基因打靶載體，在細胞周期同步于S期的山羊胚胎成纖維細胞進行基因打靶，希望獲得一種能提高基因打靶效率的方法。 [方法]: 1.從健康人體外周靜脈取靜脈血利用苯酚/氯仿方法提取基因組DNA，以此基因組DNA為模板，通過分段擴增的方

3、法擴增編碼hIL-21基因組編碼區(qū)序列。 2.從健康人體外周靜脈取靜脈血通過Ficoll密度梯度離心法分離得到淋巴細胞后，加入PMA、ConA、PHA，于37℃培養(yǎng)48hr以激活淋巴細胞，提取細胞總RNA后通過RT-PCR擴增hIL-21cDNA全長序列。 3.利用所得到的hIL-21全長基因組編碼區(qū)序列構(gòu)建一種山羊β-乳球蛋白(BLG)調(diào)控的隨機表達載體，hIL-21cDNA全長序列經(jīng)克隆重組構(gòu)建一種β-酪蛋白調(diào)控的隨

4、機表達載體，通過電轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法把兩種隨機表達載體導(dǎo)入山羊胎兒成纖維細胞中，G418抗性篩選后用PCR和Southernblot檢測鑒定陽性細胞克隆。 4.以所獲得的一株陽性細胞作為核供體，使用體細胞核移植的方法獲得重構(gòu)囊胚，移植到假孕母羊子宮中待其妊娠，并對流產(chǎn)胎兒進行整合情況的檢測。 5.通過胸腺嘧啶核苷阻斷方法使大量細胞同步在S期，然后將構(gòu)建在山羊β-酪蛋白基因位點的hIL-21打靶載體轉(zhuǎn)染已同步化的細胞，

5、對G418抗性細胞用PCR的方法檢測其基因打靶效率的變化。 [結(jié)果]: 1.使用分段擴增的方法擴增出了hIL-21基因組編碼區(qū)4kb和4.8kb的上、下游片段。所獲的hIL-21基因組編碼區(qū)上、下游片段連接后獲得全長8.3kb的hIL-21基因組編碼區(qū)DNA，并構(gòu)建出含hIL-21基因組編碼區(qū)DNA的隨機整合表達載體(pBLG-IL21G)。 2.使用PMA、ConA、PHA聯(lián)用的方法激活了淋巴細胞表達hIL-2

6、1，從激活后的淋巴細胞中提取了RNA，用RT-PCR方法擴增出了hIL-21cDNA，然后構(gòu)建出含hIL-21cDNA的隨機整合載體(pBC1-IL21C)。 3.兩種質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后用G418進行篩選，挑取抗性細胞克隆進行PCR檢測，PCR陽性細胞再繼續(xù)進行Southernblot鑒定，獲得1株pBLG-IL21G轉(zhuǎn)染陽性細胞和6株pBC1-IL21C轉(zhuǎn)染陽性細胞。 4.一株陽性細胞作為核供體細胞進行細胞核移植，共有55

7、個發(fā)育良好的重構(gòu)囊胚移植到21只假孕母羊的子宮內(nèi)，移植后35d用超聲檢測到4只母羊懷孕，4只母羊分別于妊娠48d，52d，70d，108d時流產(chǎn)，僅收集到妊娠108d的1只流產(chǎn)胎兒，經(jīng)外源基因的檢測結(jié)果表明該流產(chǎn)胎兒的基因組中整合了目標基因。 5.用打靶載體轉(zhuǎn)染細胞周期已同步化在S期的細胞，兩次轉(zhuǎn)染共獲得抗性細胞克隆560個，對這些克隆進行了同源重組位點的PCR檢測，均未能擴增出特異的條帶。 [結(jié)論]： 1.構(gòu)建

8、了一種插入了hIL-21基因組編碼區(qū)DNA的由山羊β-乳球蛋白調(diào)控的隨機整合表達載體和一種插入了hIL-21cDNA的由山羊β-酪蛋白調(diào)控的隨機整合表達載體。 2.構(gòu)建了插入了hIL-21基因組編碼區(qū)DNA和插入了hIL-21cDNA的山羊β-酪蛋白基因位點打靶載體。 3.獲得了1株整合有pBLG-IL21G的山羊胚胎成纖維細胞和6株整合有pBC1-IL21C的山羊胚胎成纖維細胞。 4.分段擴增長片段hIL-21