1、BIG-3在體外加速軟骨細胞的分化和成熟,在小鼠胚胎發(fā)育期BIG-3的表達,表明BIG-3可能是軟骨細胞分化和增生肥大的調(diào)節(jié)因子.同時,BIG-3在成骨細胞中表達并能加速成骨細胞的分化,表明BIG-3蛋白參與體內(nèi)軟骨內(nèi)骨形成過程.一.該組實驗首先采用生物軟件分析了小鼠和人BIG-3基因全長編碼序列的同源性和序列的一致性.二.使用Genbank檢索BIG-3基因序列,根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物并交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;從新

2、生小鼠顱骨中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR得到全長BIG-3產(chǎn)物;將載體和PCR產(chǎn)物雙酶切,經(jīng)連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,構(gòu)建原核表達載體并對重組子pGEX-4T-2-BIG-3進行序列測定.結(jié)果顯示所得的目的基因的序列與從GenBank中檢索到的序列完全一致.三.重組子pGEX-4T-2-BIG-3轉(zhuǎn)化BL21菌株后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在60kDa處出現(xiàn)新生表達帶,與預(yù)期分子量相符.用IPTG誘導(dǎo)1L收集細菌,超聲裂菌,離心,棄上

3、清,沉淀用8M尿素變性后梯度稀釋復(fù)性,在尿素濃度達2M時使用親和層析柱Sepharose 4B純化表達產(chǎn)物,取電泳樣品行SDS-PAGE,證實得到高純度GST-BIG-3融合蛋白.四.用純化的GST-BIG-3蛋白免疫兔,制備多克隆抗體,用雙向免疫擴散試驗測定多克隆抗體的效價,western bolt鑒定其特異性.結(jié)果制備了效價為1:128的多克隆抗體,且具有較高的特異性.五.制備pMSCVpuro-BIG-3質(zhì)粒,復(fù)蘇凍存的PT67細