1、溶繭酶是蠶蛾在羽化的過程中分泌的一種蛋白水解酶，用于水解、軟化繭的先端，以便于羽化后的蠶蛾脫繭而出。研究家蠶蛾溶繭酶，不僅對蠶蛾脫繭而出這一生理過程的認識具有重要的理論意義，而且對蠶絲蛋白的進一步開發(fā)利用也將產(chǎn)生積極的影響。 本文以公布的溶繭酶基因部分序列為基礎(GenBank登錄號：AB257565)，從剛羽化的家蠶蛾的頭部提取總RNA，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapidamplification of cDNA End

2、s，RACE)克隆了家蠶溶繭酶5'端和3'端序列，獲得了家蠶蛾溶繭酶基因全長cDNA序列(GenBank登錄號：EF428980)，該序列全長cDNA有1 047 bp，包括54 bp的5'端非編碼區(qū)(5qUTR)、780 bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、終止密碼子TAA和210 bp的3'端非編碼區(qū)(3UTR)。該序列可編碼260個氨基酸的蛋白質(zhì)，預測蛋白質(zhì)分子量為27.6 kD，等電點(pI)為8.886。與家蠶基因組比對后發(fā)現(xiàn)該基因包含4個內(nèi)

3、含子和5個外顯子，外顯子／內(nèi)含子邊界符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)則。用Signa1 P 3.0 Server程序分析家蠶蛾溶繭酶基因，預測其從第1-22位為信號肽序列。SMART分析結(jié)果預測其第34.254位氨基酸序列具有類胰蛋白的絲氨酸蛋白酶活性，并且利用生物軟件DNASTAR分析了家蠶蛾溶繭酶基因cDNA序列的調(diào)控元件，這些可為今后對溶繭酶基因的進一步研究提供參考。 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-Cocoonase轉(zhuǎn)化E.coli

4、 BL21進行原核表達，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，家蠶溶繭酶基因以融合蛋白形式表達，相對分子量為48 kD。本研究還進一步構(gòu)建了該基因的真核表達載體，在Bac-to-Bac系統(tǒng)中進行表達，表達的27.6 kD蛋白，與推導的融合蛋白大小相符。該表達產(chǎn)物與繭絲反應后，在電鏡下觀察繭絲的形態(tài)，結(jié)果表明，表達產(chǎn)物對繭絲的絲膠層有一定的水解作用。 為了利用家蠶溶繭酶基因的啟動子構(gòu)建能夠表達外源基因的生物工廠，通過PCR擴增獲得該基因的